Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure
Summary
Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.
Abstract
TGF-β hat entgegengesetzte Rollen bei Brustkrebs Progression, indem sie als Tumorsuppressor in der Anfangsphase, aber anregend Invasion und Metastasierung zu einem späteren Zeitpunkt 1,2. Darüber hinaus ist TGF-β häufig bei Brustkrebs überexprimiert und seine Expression korreliert mit einer schlechten Prognose und Metastasierung 3,4. Die Mechanismen, durch die TGF-β induziert Invasion nicht gut verstanden sind.
TGF-β entlockt seiner zellulären Reaktionen via TGF-β Typ II (TβRII) und Typ I (TβRI)-Rezeptoren. Bei TGF-β-induzierte heteromeren Komplexbildung, phosphoryliert TβRII die TβRI. Die aktivierte TβRI initiiert seine intrazelluläre kanonischen Signalweges durch Phosphorylierung Rezeptor Smads (R-Smads), dh Smad2 und Smad3. Diese aktivierten R-Smads Form heteromeren Komplexe mit Smad4, die im Zellkern ansammeln und regulieren die Transkription von Zielgenen 5. Zusätzlich zu den zuvor described Smad Signalweg, Rezeptor-Aktivierung führt zur Aktivierung von mehreren anderen nicht-Smad Signalwege, zB Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) Signalwege 6.
Zur Untersuchung der Rolle der TGF-β in verschiedenen Stadien des Brustkrebses, benutzten wir die MCF10A Zellsystem. Dieses System besteht aus spontan immortalisierte MCF10A1 (M1) Brustepithelzellen 7, verwandelte die H-RAS M1-derivative MCF10AneoT (M2), die Präkanzerosen produziert in Mäusen 8 und die M2-Derivat MCF10CA1a (M4), die von gegründete M2 Xenotransplantate und Formen hochgradige Karzinome mit der Fähigkeit, die Lunge 9 metastasieren. Diese MCF10A Serie bietet die Möglichkeit, die Reaktionen der Zellen mit verschiedenen Graden der Bösartigkeit, die nicht durch einen anderen genetischen Hintergrund sind voreingenommen zu studieren.
Für die Analyse der TGF-β-induzierte Invasion, generierten wir homotypische MCF10A Sphäroid Zellkulturen embedded in einer 3D-Kollagen-Matrix in vitro (Abb. 1). Solche Modelle ähneln menschlichen Tumoren in vivo durch die Errichtung eines Gradienten von Sauerstoff und Nährstoffen, was aktive und invasive Zellen auf der Außenseite und Ruhe oder auch abgestorbene Zellen in das Innere des Sphäroids 10. Spheroid basierte Assays haben auch gezeigt, dass bessere rekapitulieren drug resistance als Monolayer-Kulturen 11. Diese MCF10 3D-Modell-System erlaubt es uns, die Auswirkungen von TGF-β-Signalisierung auf der invasiven Eigenschaften von Brust-Zellen zu untersuchen in verschiedenen Stadien der Bösartigkeit.
Protocol
Discussion
Wir haben ein Sphäroid Modell, in dem MCF10A1 Zellen und ihre bösartigen Derivate in eine Kollagen-Matrix in einem TGF-β-abhängigen Weise zu erobern. Erstens sind Sphäroide in 96-Wells mit rundem Boden Aufhängeplatten in Gegenwart von Methylcellulose gebildet. Natürlich können auch U-förmigen Poly-HEMA beschichteten Platten für diesen Zweck verwendet werden. Methylcellulose ist absolut in dieser Schritt erforderlich, da die Zellen in Abwesenheit von Methylcellulose sterben. TGF-β ist direkt an die Kollagen-Me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) für Reagenzien und Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Intitute, Detroit, USA) für die Zell-Linien.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
Referências
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