Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em
Summary
En metode til at generere organotypiske skiver fra E12.5 murine embryonale midthjernen er beskrevet. Den organotypiske skive kulturer kan bruges til at observere opførslen af dopaminerge neuroner eller andre ventral midthjernen neuroner.
Abstract
Musen er en fremragende model organisme for at studere pattedyr hjernens udvikling på grund af den overflod af molekylære og genetiske data. Men udviklingslandene musen hjernen er ikke egnet for nem manipulation og billedbehandling in vivo, da musen fosteret er utilgængelige og uigennemsigtig. Organotypiske skive kulturer af embryonale hjerner er derfor i vid udstrækning anvendes til at studere murine hjernens udvikling in vitro. Ex-vivo manipulation eller anvendelse af transgene mus giver mulighed for ændring af genekspression, så delpopulationer af neuronale eller gliaceller kan være mærket med fluorescerende proteiner. Den adfærd mærkede celler kan derefter ses ved hjælp af time-lapse billeddannelse. Time-lapse billeddannelse har været særdeles vellykket for at studere celle adfærd, der ligger bag udviklingen af hjernebarken på sene embryonale stadier 1-2. Embryonale organotypiske skive kultur systemer i hjernen regioner uden for forhjernen er mindre godt establisHED. Derfor er det væld af time-lapse imaging data, der beskriver neuronal cellemigration begrænset til forhjernen 3,4. Det er endnu ikke kendt, hvorvidt principperne opdaget for dorsale hjernen gælde for ventral områder i hjernen. I den ventrale hjernen, er neuroner organiseret i neuronal klynger snarere end lag og de ofte nødt til at gennemgå komplicerede vandrende baner for at nå deres endelige holdning. Den ventrale midthjernen er ikke kun en god model system til ventrale hjernens udvikling, men indeholder også neuronale populationer som dopaminerge neuroner, der er relevante i sygdom processer. Mens funktion og degeneration af dopaminerge neuroner er blevet undersøgt i detaljer i den voksne og aldrende hjernen, er meget lidt viden om opførsel af disse neuroner i løbet af deres differentiering og migration fase 5. Vi beskriver her den generation af skive kulturer fra den embryonale dag (e) 12,5 musen ventrale midthjernen. Disse skive kultninger er potentielt egnede til overvågning af dopaminerge neuroner udvikling over flere dage in vitro. Vi fremhæver de vigtige skridt i at generere hjernen skiver på disse tidlige stadier af fosterudviklingen og drøfte de nødvendige betingelser for at opretholde en normal udvikling af dopaminerge neuroner in vitro. Vi har også præsentere resultater fra tid bortfalder billeddannelse eksperimenter. I disse forsøg blev ventrale midthjernen prækursorer (inklusive dopaminerge prækursorer) og deres efterkommere er mærket i en mosaik måde ved hjælp af en Cre / loxP baseret inducerbare skæbne mapping system 6.
Protocol
Discussion
Den organotypiske skive kultur metode præsenteret her giver et system på kort sigt in vitro analyse af udviklingen af dopaminerge neuroner og deres træk og projektion ruter i embryonale ventrale midthjernen. Vi fandt, at der er en række kritiske trin i den protokol, bør nøje deltog i for at opnå skiver, der tillader den normale udvikling af ventrale midthjernen dopaminerge neuroner. Det mest kritiske skridt er dissektion af embryonale hjernen, som skal være både hurtig og præcis. I modsætning til den…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Martine Emond og Isabel Brachmann for deres hjælp med at etablere de organotypiske skive kultur-system og Wolfgang Hübner og Liviu Gabriel Bodea til kritisk læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Frank Costantini for R26 reporter mus og Cliff Tabin for Shh CreER mus. Denne undersøgelse blev finansieret af et Research Award fra Ministeriet for Videnskab og forskning i delstaten Nordrhein-Westfalen (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
Referências
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41-41 (2009).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-29 (2007).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).
- Legue, E., Joyner, A. L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).
- Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc. , (2007).
- Harfe, B. D. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-517 (2004).
- Srinivas, S. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).
- Joksimovic, M. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).
- Blaess, S. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).
