胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em
Summary
E12.5マウス胚中脳から器官型スライスを生成する方法が記載されている。器官切片培養は、ドーパミン作動性ニューロンや他の腹側中脳の神経細胞の挙動を観察するために使用することができます。
Abstract
マウスは、分子や遺伝子データの豊富さに起因する哺乳類の脳の発達を研究するための優れたモデル生物です。マウスの胚にアクセスできず、不透明であるしかし、発展途上のマウスの脳は、 生体内で容易な操作と画像処理には適していません。胎児の脳の器官切片培養したがって、広くin vitroでマウスの脳の発達を研究するために使用されています。 生体外の操作やトランスジェニックマウスの使用ニューロンやグリア細胞の亜集団は、蛍光タンパク質で標識することができるように遺伝子発現を変更できます。標識された細胞の挙動は、タイムラプスイメージングを用いて観察することができます。タイムラプスイメージングは、後期胚の段階1-2に大脳皮質の発達の基礎となる細胞の挙動を研究するために、特に成功している。前脳の外側の脳領域における胚器官スライス培養系ではあまりよくestablisですHED。したがって、神経細胞の遊走を記述するタイムラプスイメージングデータの富は前脳3,4に限定されています。それは、背側の脳のために発見された原則は、腹側脳の領域に対しても当てはまるかどうか、まだ知られていないです。腹側脳では、神経細胞は神経細胞のクラスターではなく、レイヤーで構成されており、彼らはしばしば、彼らの最終的な位置に到達するための複雑な渡り鳥軌道を受けなければならない。腹側中脳は腹側脳の発達のための唯一の良いモデル系ではなく、またそのような病気のプロセスに関連するドーパミン作動性ニューロンなどの神経集団が含まれています。ドーパミン作動性ニューロンの機能と変性が成人と高齢化、脳内の非常に詳細に研究されている一方で、少しはその分化と移行フェーズ5の間にこれらのニューロンの振る舞いについては知られている。ここでは、胎生（E）12.5マウス腹側中脳から切片培養の生成を説明します。これらのスライスカルトURESは、in vitroで数日間にわたってドーパミン作動性ニューロンの開発を監視するための潜在的に適しています。我々は、胚発生のこれらの初期の段階で脳のスライスを生成するための重要なステップを強調表示し、in vitroでドーパミン作動性ニューロンの正常な発展を維持するために必要な条件を議論する。タイムラプスイメージング実験から我々はまた、今回の結果。これらの実験では、腹側中脳前駆体（ドパミン前駆体を含む）およびその子孫は、Creを/つのloxPベースの誘導性の運命のマッピングシステム6を使用してモザイクのように標識した。
Protocol
Discussion
ここで紹介する器官のスライス培養法は、胚の腹側中脳のドーパミン作動性ニューロンとそれらの回遊と投影経路の開発の in vitro解析における短期的なシステムを提供する。我々は慎重に腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの正常な発展を可能にするスライスを得るためにに出席されるべきプロトコルの重要なステップの数があることがわかった。最も重要なステップは、高?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は器官のスライス培養系とヴォルフガングヒューと原稿の重要な読書のためのLiviuガブリエルBodeaを確立する彼らの助けのためにマルティーヌEmondとイザベルBrachmannに感謝。我々は、ShhのCreERマウスのためのR26レポーターマウスとクリフTabin用フランクコンスタンティーニに感謝します。本研究では、ノルトラインヴェストファーレン州（PROGRAMMツアFörderungルワールRückkehrデwissenschaftlichen Spitzennachwuchses AUS DEM Ausland）の科学研究省から研究賞によって資金を供給された。
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
Referências
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