Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII
Summary
Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende<em> C. elegans</em> Het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in<em> C. elegans</em> Om het milieu worden blootgesteld neuronen te visualiseren. Met dit geoptimaliseerde protocol, zijn alae en ringvormige structuren cuticulair gekleurd door DII en geobserveerd met behulp van microscopie compound.
Abstract
De cuticula van C. elegans is een zeer resistent structuur die de buitenkant van het dier 1-4 omringt. De nagelriem beschermt niet alleen het dier uit de omgeving, maar ook bepalend voor lichaamsvorm en speelt een rol in de motiliteit 4-6. Meerdere lagen afgescheiden door epidermale cellen bestaan uit de nagelriem, waaronder een buitenste lipide laag 7.
Omtrek ribbels in de cuticula genoemd annuli patroon de lengte van het dier en zijn aanwezig tijdens alle stadia van ontwikkeling 8. Alae zijn richels in de lengterichting die aanwezig zijn tijdens specifieke stadia van ontwikkeling, waaronder L1, Dauer, en volwassen stadia 2,9. Mutaties in genen die cuticulair collageen organisatie beïnvloeden kan veranderen cuticulair structuur en dierlijk lichaam morfologie 5,6,10,11. Terwijl cuticulair imaging met behulp van microscopie compound met DIC optiek is het mogelijk, de huidige methoden die de aandacht vestigen cuticulair structuren omvatten fluorescentielampencent transgenexpressie 12, antilichaam vlekken 13, en elektronenmicroscopie 1. Gelabeld tarwekiemen agglutinine (WGA) is ook gebruikt om cuticulair glycoproteïnen visualiseren, maar is beperkt in het oplossen van fijnere structuren cuticulair 14. Kleuring van cuticulair oppervlak met behulp van fluorescerende kleurstof is waargenomen, maar nooit in detail gekarakteriseerd 15. Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende C. elegans het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in C. elegans om milieuvriendelijke blootgesteld neuronen te visualiseren. Dit geoptimaliseerde protocol voor DII kleuring is een eenvoudige, robuuste methode voor hoge resolutie fluorescentie visualisatie van annuli, alae, vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete piek in de C. elegans.
Protocol
Discussion
De Dii kleuringsmethode hier gepresenteerde zorgt voor een relatief snelle en gemakkelijke manier om de cuticula in C. elegans te visualiseren. Door herbestemming en optimaliseren van een methode die vaak wordt gebruikt om de afbeelding milieuvriendelijke blootgesteld sensorische neuronen 15,17, kan DII worden gebruikt om de fluorescent vlek zowel alae en ringvormige structuren (figuren 1 en 2), evenals de vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete spike (Figuur 3). We hebben geconstateerd dat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, en HC bedanken. Hsiao voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door start-up middelen van de TAMHSC Departement Moleculaire en Cellulaire Geneeskunde. De verbinding reikwijdte en de draaiende schijf werden aangekocht met geld van de afdeling en de TAMHSC bureau van de decaan. Sommige stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door het National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) was een geschenk van A. Fire.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
Referências
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. . C. elegans Atlas. , (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. v. o. n., Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genética. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
