תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle
Summary
Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.
Abstract
חלבונים ממברנה (MPS) לשחק תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים כגון שאיבת מולקולות ספציפיות על פני קרום חדיר bilayer אחרת שמקיפה את כל התאים אברונים. שינויים בתפקוד של חברי פרלמנט תוצאה של מחלות אנושיות והפרעות רבים, ולכן הבנה מורכבת של המבנה שלהן נותר מטרה קריטית עבור מחקר ביולוגי. עם זאת, קביעת מבנה של חברי פרלמנט עדיין מהווה אתגר משמעותי הנובע לעתים קרובות hydrophobicity שלהם.
חברי פרלמנט יש אזורים הידרופובי משמעותי מוטבע בתוך bilayer. דטרגנטים משמשים לעיתים קרובות solubilize החלבונים האלה מן bilayer יצירת micelle אבקת חלבון כי אז יכול להיות מטופל בצורה דומה כמו חלבונים מסיסים. באופן מסורתי, ניסויים התגבשות להתקדם באמצעות תערובת חלבונים חומרי ניקוי, אבל לעתים קרובות הם להתנגד התגבשות או לייצר גבישים באיכות ירודה. בעיות אלה מתעוררות בשלחוסר היכולת של חומר ניקוי כראוי לחקות את bilayer וכתוצאה מכך יציבות ההטרוגניות עניים. בנוסף, מגן חומר ניקוי המשטח ההידרופובי של MP הקטנת שטח זמין עבור אנשי הקשר קריסטל. כדי לעקוף את חברי פרלמנט אלה חסרונות יכול להיות מגובשת בתקשורת lipidic, אשר באופן הדוק יותר המדמה סביבת אנדוגניים שלהם, הפך לאחרונה טכניקה דה נובו לגיבוש MP.
Lipidic שלב מעוקב (LCP) היא bilayer תלת ממדי השומנים חדרה על ידי מערכת של תעלות מחוברים מימית 1. למרות monoolein הוא השומנים של בחירה, שומנים נלווים כגון monopalmitolein ו monovaccenin יש גם נהגה להכין LCP 2. חברי פרלמנט ישולבו LCP שבו הם מפוזר בשלושה ממדים קריסטל גרעינים להאכיל. היתרון הגדול של LCP היא כי החלבון נשאר בסביבה יליד יותר, אבל השיטה יש מספר חסרונות טכניים כולל visc גבוהosity (הדורשים מנגנוני המקצועית) וקשיים להדמיה קריסטל מניפולציה 3,4. בגלל קשיים טכניים אלה, אנו מנוצל אחר בינוני lipidic לגיבוש-bicelles 5,6 (איור 1). Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile נוצר על ידי ערבוב השומנים phosphatidylcholine (DMPC) עם amphiphile (CHAPSO) או שומנים קצרות שרשרת (DHPC). בתוך כל דיסק bicelle, מולקולות הליפידים ליצור bilayer ואילו מולקולות קו amphiphile את הקצוות apolar מתן תכונות מועילות הן bilayers ודטרגנטים. חשוב לציין, מתחת לטמפרטורת המעבר שלהם, חלבונים bicelle תערובות יש צמיגות מופחתת הם מניפולציה באופן דומה כמו חומרי ניקוי, solubilized חברי פרלמנט, מה שהופך bicelles תואם רובוטים התגבשות.
Bicelles שימשו בהצלחה לגבש חלבונים בממברנה מספר 5,7-11 (טבלה 1). אוסף זה גדלשל חלבונים ממחישה את הרבגוניות של bicelles על גיבוש שתי הסליל אלפא ביתא חברי פרלמנט גיליון ממקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. בגלל אלה ההצלחות ואת הפשטות של יישום תפוקה גבוהה, bicelles צריכה להיות חלק ארסנל כל חלבון בממברנה של crystallographer. בסרטון הזה, אנו מתארים את המתודולוגיה bicelle ולספק פרוטוקול צעד אחר צעד להקמת תפוקה גבוהה ניסויים התגבשות של חברי פרלמנט מטוהרים באמצעות רובוטיקה סטנדרטי.
Protocol
Discussion
Bicelles הם מדיה lipidic ייחודי מציעים סביבת יליד bilayer כמו בעוד מתנהג כאילו solubilized ידי דטרגנטים. מאפיין זה נותן bicelles יתרון בולט על פני השומנים מבוסס שיטות אחרות התגבשות שכן אין עקומת למידה או ציוד מיוחד נדרש עבור טכניקה זו. לאחר bicelles זמינים, או מסחרי או מוכן במעבדה, הם יכולים ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות בני הזוג. ג'יימס בואי סאלם Faham למתן מומחיות הדרכה טכנית על השיטה bicelle וד"ר אביב פז לדיונים מועילים. אנו מודים לה דו לתמיכה ניסיונית. Rachna Ujwal יש אינטרס כלכלי MemX Biosciences LLC, אשר, לעומת זאת, לא תמך את העבודה הזאת. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
