Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri
Summary
Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri içeren, protokoller açıklamaktadır.
Abstract
Membran proteinleri (MP) gibi özel moleküller, tüm hücre ve organeller çevreleyen başka geçirimsiz membran bilayeri üzerinden pompalama gibi birçok fizyolojik süreçler kritik bir rol oynar. Birçok insan hastalık ve bozukluklar milletvekilleri sonucu işlevini değişiklikler; böylece, yapıları karmaşık bir anlayış, biyolojik araştırmalar için kritik bir hedefi olmaya devam ediyor. Ancak, milletvekillerinin yapı tayini genellikle hidrofobik kaynaklanan önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.
Milletvekilleri bilayeri içinde gömülü önemli hidrofobik bölgelerde var. Deterjanlar sonra çözünür proteinler gibi benzer bir şekilde manipüle edilebilir bir protein-deterjan üreten Misel bilayeri sık sık bu proteinlerin çözünür kullanılır. Geleneksel olarak, kristalizasyon çalışmalarda bir protein-deterjan karışımı kullanarak devam edin, ama genellikle kristalleşme karşı veya kalitesiz kristaller üretmek. Bu sorunlar nedeniyle ortaya çıkandeterjan yetersizliği yeterince kötü istikrar ve heterojenite ile sonuçlanan bilayeri taklit etmek. Buna ek olarak, deterjan kalkanlar MP hidrofobik yüzey kristal kişiler için yüzey alanı azaltır. Aşmak için bu sakıncaları milletvekilleri, daha yakından, endojen ortamını uyaran lipidik medya, kristalize olması, ve son zamanlarda MP kristalizasyon için de novo tekniği haline gelmiştir.
Lipidik kübik faz (LCP) sulu kanal 1 bir enterkonnekte sistem tarafından nüfuz üç boyutlu çift katlı lipid. Monoolein seçim lipid olmasına rağmen, ilgili lipidler gibi monopalmitolein ve monovaccenin olarak da LCP 2 yapmak için kullanılır olmuştur. Milletvekilleri, üç boyutlu ve yem kristal çekirdekleri diffüz LCP içine dahil edilmiştir. LCP en büyük avantajı, protein, daha doğal bir ortamda kalmasını, ancak yöntem yüksek visc de dahil olmak üzere bir dizi teknik dezavantajları vardırosity (uzman aparatları gerektiren) ve kristal görselleştirme ve manipülasyon 3,4 zorluklar. Çünkü bu teknik zorluklar, kristalizasyon-bicelles 5,6 (Şekil 1) için başka bir lipidik orta kullandı. Bicelles amphiphile (CHAPSO) ya da kısa zincirli yağ (DHPC) ile fosfatidilkolin lipid (DMPC) harmanlayarak oluşturduğu lipid / amphiphile karışımları. Amphiphile molekülleri hattı apolar kenarları bilayers ve deterjanlar hem de faydalı özellikleri sunarken, her bicelle disk içerisinde lipid molekülleri bilayeri oluşturmak. Önemlisi, kendi geçiş sıcaklığı altında, protein bicelle karışımları, düşük viskozite ve kristalizasyon robotlar ile bicelles uyumlu hale getirir, deterjan-çözünür milletvekilleri benzer bir şekilde manipüle edildi.
Bicelles birkaç zarı proteinleri 5,7-11 (Tablo 1) kristalize başarıyla kullanılmaktadır. Bu kolleksiyonuproteinler, alfa sarmal ve beta yaprak milletvekilleri hem de prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan kristalize için bicelles çok yönlülüğünü gösteriyor. Çünkü bu başarıları ve yüksek verimli uygulama basitliği, bicelles her membran proteini kristalbilimciydi cephaneliğinin bir parçası olmalıdır. Bu video, bicelle yöntemini açıklar ve standart robotik kullanarak milletvekilleri saflaştırılmış, yüksek verimli kristalizasyon çalışmalarda kurmak için bir adım-adım protokolü sağlamak.
Protocol
Discussion
Bicelles eşsiz bir lipidik medya deterjanların çözünür gibi davranmaya gibi yerli çift katlı bir ortam sunuyoruz. Bu özellik, herhangi bir öğrenme eğrisi ya da bu tekniği için gerekli olan özel ekipman olmadığından bicelles diğer lipid tabanlı kristalizasyon yöntemleri üzerinde ayrı bir avantaj sağlar. Bicelles, ticari ya da laboratuarda hazırlanan mevcuttur, kristalizasyon çalışmalarda neredeyse tam standart deterjan bazlı protokolleri ile devam saflaştırılmış protein ve bu noktadan it…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. James Bowie ve Salem Faham bicelle yöntemi ve faydalı tartışmalar için Dr. Aviv Paz teknik uzmanlık ve rehberlik sağlamak için. Biz deneysel destek için Le Du kabul etmiş sayılırsınız. Rachna Ujwal Ancak, bu işe destek vermedi, MemX Biosciences LLC mali çıkarı var. Bu çalışma NIH (RO1 GM078844) hibe kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
