Vi beskriver brugen af perfluorodecalin som en infiltrativ montering medium. Dette er en enkel metode til at forbedre dybde af billeddiagnostik<em> Arabidopsis thaliana</em> Blad væv med minimal fysiologisk effekt.
Problemet med at erhverve høj opløsning billeder dybt ind i biologiske prøver, er almindeligt anerkendt 1. I luftfyldt væv såsom svampede mesophyll af plante-blade eller hvirveldyr lunger yderligere vanskeligheder, der opstår fra flere overgange i brydningsindeks mellem cellulære komponenter, mellem celler og luftrum og mellem biologisk væv og resten af det optiske system. Desuden brydningsindeks misforhold føre til svækkelse af fluoroforen excitation og signal emission i fluorescens mikroskopi. Vi beskriver her anvendelsen af perfluorcarbon, perfluorodecalin (PFD), som en infiltrativ imaging medium, der er optisk forbedrer laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM) prøve billeddannelse i dybden, uden at ty til skadelige stigninger i laser magt og har en minimal fysiologisk virkning 2. Vi beskriver en protokol for brugen af PFD med Arabidopsis thaliana blade væv, som er optisk kompleks som følge afstruktur (Figur 1). PFD har en række egenskaber, der gør det egnet til dette brug 3. Brydningsindekset af PFD (1,313) er sammenlignelig med vand (1,333) og er tættere på, at i cytosolen (ca. 1,4) end luft (1.000). Desuden er PFD let tilgængelige, ikke-fluorescerende og er ikke giftig. Den lave overfladespænding PFD (19 dynes cm -1) er lavere end vands (72 dynes cm -1), og også under den grænse (25 til 30 dyn cm -1) for stomatal penetration 4, der gør det muligt at oversvømme den svampede mesophyll luftrum og uden anvendelse af en potentielt ødelæggende vakuum eller overfladeaktivt stof. Endelig og afgørende, PFD har en stor evne til at opløse CO 2 og O 2, som giver gasudveksling der skal opretholdes i de oversvømmede væv og derved minimere den fysiologiske effekt på prøven. Disse egenskaber har været brugt i forskellige applikationer, der omfatter delvis flydende vejrtrækning og lunger inflationtion 5,6, kirurgi 7, kunstigt blod 8, iltningen af vækstmedier 9, og studier af iskrystal dannelse i planter 10. I øjeblikket er det almindeligt at montere væv i vand eller vandige buffer til live konfokal billedbehandling. Vi mener, at brugen af PFD som Mounting Medium er en forbedring på eksisterende praksis og giver den enkle tilberedning af levende hele blade prøver til billeddannelse.
Dette er en enkel og let at bruge teknik til at forbedre mikroskopi af luftfyldte eller optisk komplekse væv. Vi har vist, at teknikken har nogle stærke fordele, og vi håber, at det vil blive brugt til at belyse biologiske spørgsmål vedrørende luft-rige væv. For eksempel ville det være et naturligt valg for studier af patogen angreb i anlægget mesophyll eller i lungerne. Vi har også er opmærksomme på begrænsningerne af teknikken. Vi arbejder på bedre brydningsindeks matching, brug med andre former for mikroskopi, og perfluorcarbon indlejringsolie opfyldning under lange tidsskala eksperimenter. Vi anerkender også, selv om, at en af de største fordele af PFC, nemlig at være biologisk inaktivt har en Flipside. PFC ikke let opløses biologiske molekyler, som også indebærer, at de ikke let kan benyttes til at levere forbindelser af interesse såsom hormoner, narkotika og andre små molekyler eller ioner.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke professor Nicholas Smirnoff fra University of Exeter for hans råd og University of Exeter Bioimaging Facility. Finansieringen blev givet af den britiske Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (fastlæggelse af referencebeløb BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |