Vi beskriver användningen av perfluorodecalin som en infiltrativ monteringsmedel. Detta är en enkel metod för att förbättra djup avbildning i<em> Arabidopsis thaliana</em> Bladvävnad med minimal fysiologisk effekt.
Problemet med att skaffa högupplösta bilder djupt in i biologiska prover är allmänt erkänt 1. I luftfyllda vävnad såsom den svampiga mesophyll växt löv eller ryggradsdjur lungor ytterligare svårigheter uppstå från flera övergångar i brytningsindex mellan cellulära komponenter, mellan celler och luftrum samt mellan biologisk vävnad och resten av det optiska systemet. Dessutom brytningsindex obalans leder till dämpning av fluoroforen excitation och signal utsläpp i fluorescensmikroskopi. Vi beskriver här tillämpningen av perfluorkarbon, perfluorodecalin (PFD), som ett infiltrativ avbildning medium som optiskt förbättrar laserskanning konfokalmikroskopi (LSCM) prov bildhantering på djupet, utan att ta till skada ökar i laser makt och har minimal fysiologisk effekt 2. Vi beskriver protokollet för användning av flytväst med Arabidopsis thaliana bladvävnad, som är optiskt komplex som ett resultat av dessstruktur (figur 1). PFD har ett antal egenskaper som gör den lämplig för användning 3. Den brytningsindex PFD (1,313) är jämförbar med den i vatten (1,333) och är närmare den cytosolen (ca 1,4) än luft (1,000). Dessutom är flytväst lätt tillgängliga, icke-lysrör och är giftfri. Den låga ytspänningen i PFD (19 dynes cm -1) är lägre än vatten (72 dynes cm -1) och även under gränsen (25 till 30 Dyne cm -1) för stomatakonduktans penetration 4, vilket gör att den översvämning den svampiga mesophyll luftrum utan tillämpning av en potentiellt destruktiv vakuum eller tensider. Slutligen och viktigast, har flytväst en stor kapacitet för att lösa CO 2 och O 2, som tillåter gasutbyte måste behållas i den översvämmade vävnaden, vilket skulle minimera fysiologiska påverkan på provet. Dessa egenskaper har använts i olika applikationer som inkluderar delvis flytande andnings-och lung-inflationention 5,6, kirurgi 7, konstgjort blod 8, syresättning av tillväxt Media 9, och studier av is kristaller bildas i växter 10. För närvarande är det vanligt att montera vävnad i vatten eller buffert för live konfokala avbildning. Vi anser att användningen av flytväst som monteringsmedium är en förbättring av befintlig praxis och tillåter enkel bearbetning av levande hela blad prover för avbildning.
Detta är en enkel och lätt att använda tekniken för att förbättra mikroskopi av luftfyllda eller optiskt komplex vävnader. Vi har visat att tekniken har några starka fördelar och vi hoppas att det kommer att användas för att belysa biologiska frågor som rör luft-rik vävnader. Till exempel skulle det vara ett naturligt val för studier av patogener attack i fabriken mesophyll eller i lungorna. Vi är också medvetna om de begränsningar av tekniken. Vi arbetar för bättre brytningsindex matchning, användning med andra typer av mikroskopi och perfluorkarbon monteringsvätska påfyllning under långa tidsperiod experiment. Vi inser emellertid också att en av de största fördelarna med PFC, nämligen att vara biologiskt inert har en flipside. PFC inte löses upp lätt biologiska molekyler som också innebär att de inte lätt kan användas för att leverera föreningar av intresse, till exempel hormoner, droger, och andra små molekyler eller joner.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka professor Nicholas Smirnoff på University of Exeter för hans råd och University of Exeter Bioimaging Facility. Finansiering gavs av det brittiska bioteknik och Biological Sciences Research Council (bidrag referens BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |