Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster</em
Summary
Fenotypische variatie voor de kenmerken kan het gevolg zijn van mutaties in cis-regulerende element (CRE) sequenties die de controle genexpressie patronen. Methoden afgeleid voor gebruik in Drosophila melanogaster kan kwantitatief vergelijken met het niveau van de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie gemedieerd door gewijzigde of natuurlijk voorkomende CRE varianten.
Abstract
Genexpressie patronen worden gespecificeerd door cis-regulerende element (CRE) sequenties, die ook worden genoemd enhancers of cis-regulatorische modules. Een typische CRE beschikt over een regeling van bindingsplaatsen voor diverse transcriptiefactor eiwitten die een regulerende logica te geven wanneer, waar en op welk niveau het gereguleerde gen (s) wordt uitgedrukt verlenen. De volledige set Cres in een dier genoom codeert voor het organisme-programma voor ontwikkeling van een, en empirische als theoretische studies tonen aan dat mutaties in Cres een prominente rol gespeeld in morfologische evolutie 2-4. Bovendien, het menselijk genoom wide association studies wijzen erop dat genetische variatie in Cres wezenlijke bijdrage leveren aan fenotypische variatie 5,6. Zo, het begrijpen van de regelgeving logica en hoe mutaties invloed hebben op een dergelijke logica is een centrale doelstelling van de genetica.
Reporter transgenen bieden een krachtige methode om de studie van de in vivo functieTIE Cres. Hier een bekende of vermoede CRE sequentie wordt gekoppeld aan heterologe promoter en coderende sequenties voor een reporter gen dat codeert voor een gemakkelijk waarneembare eiwit product. Toen een journalist transgen wordt ingebracht in een gastheerorganisme, de CRE de activiteit wordt zichtbaar in de vorm van de gecodeerde reporter eiwit. P-element gemedieerde transgenese in de fruitvlieg Drosophila soorten (D.) melanogaster 7 is gebruikt voor de komende decennia reporter transgenen te introduceren in dit model organisme, hoewel de genomische plaatsing van transgenen is willekeurig. Daarom is het reportergen-activiteit sterk beïnvloed door de lokale chromatine en gen-omgeving, het beperken van CRE vergelijkingen met zijn kwalitatief. In de afgelopen jaren, was de phiC31 gebaseerde integratie-systeem aangepast voor gebruik in D. melanogaster om transgenen in te voegen in specifieke genoom landingsplaatsen 8-10. Deze mogelijkheid heeft de kwantitatieve meting van gen-en, hier van belang, CRE-activiteit 11 tot 13 feasible. De productie van transgene fruitvliegjes kan worden uitbesteed, zoals phiC31-gebaseerde integratie, waardoor de noodzaak om dure apparatuur kopen en / of vaardigheden bij gespecialiseerde transgen injectie protocollen.
Hier presenteren we een algemeen protocol om kwantitatief te evalueren een CRE activiteit, en laten zien hoe deze aanpak kan worden gebruikt om de effecten van een mutatie geïntroduceerd op de activiteit een CRE's te meten en de activiteiten van de orthologe CRES vergelijken. Hoewel de gegeven voorbeelden zijn voor een CRE actief tijdens de fruitvlieg metamorfose, kan de aanpak worden toegepast op andere ontwikkelingsstadia, fruitvlieg soorten, of model organismen. Uiteindelijk moet een meer wijdverbreide gebruik van deze aanpak om te studeren CRES vooraf een goed begrip van de regelgeving logica en hoe logica kan variëren en evolueren.
Protocol
Discussion
cis-regulatorische elementen coderen genomische programma dat de genexpressie patronen en daarmee het proces van ontwikkeling een specificeert, en zijn prominente locaties voor beide mutaties ten grondslag liggen aan morfologische evolutie 2-4 en fenotypische variatie voor menselijke trekjes 5,6,19. Ondanks dit belang, blijven de wettelijke logica voor Cres slecht begrepen. Een prominente reden voor dit inzicht tekort is het gebrek aan geschikte methoden om kwantitatief te verge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken: Nicolas Gompel en Benjamin Prud'homme voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol, Melissa Williams en vier anonieme reviewers voor commentaar op het manuscript, de Universiteit van Dayton Graduate School voor onderzoek beurzen naar WAR, en de University of Dayton Biology afdeling en Research Institute (UDRI) voor ondersteuning van onderzoek voor TMW. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11BGIA7280000 aan TMW.
Referências
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. . Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. , (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. . Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , (2007).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
