Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em
Summary
Phänotypische Variation für Züge können durch Mutationen in cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die Kontrolle Genexpressionsmuster führen. Methoden für den Einsatz in Drosophila melanogaster abgeleitet werden können quantitativ vergleichen Sie die Ebenen der räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression durch modifizierte oder natürlich vorkommende Varianten CRE vermittelt.
Abstract
Genexpressionsmuster von cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die auch als Enhancer oder cis-regulatorischen Modulen angegeben. Ein typisches CRE besitzt eine Anordnung von Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren Proteine, die eine regulatorische Logik angeben, wann, wo und auf welcher Ebene die regulierten Gens (s) zum Ausdruck zu verleihen. Der vollständige Satz von Cres in ein Tier Genom kodiert des Organismus Programm für die Entwicklung 1 und empirische als auch theoretische Studien zeigen, dass Mutationen in Cres eine herausragende Rolle spielte in morphologische Evolution 2-4. Darüber hinaus deuten die menschliche genomweiten Assoziationsstudien, dass die genetische Variation in CREs tragen wesentlich zur phänotypischen Variation 5,6. So Verständnis regulatorischen Logik und wie Mutationen betreffen solche Logik ist ein zentrales Ziel der Genetik.
Reporter Transgene bieten eine leistungsfähige Methode, um die in vivo Funktion StudieTION Cres. Hier ist ein bekannter oder vermuteter CRE-Sequenz ist zu heterologen Promotor und kodierenden Sequenzen für ein Reporter-Gen kodiert ein leicht beobachtbaren Protein-Produkt gekoppelt. Als ein Reporter-Transgen in einen Wirtsorganismus eingesetzt ist, wird die CRE die Aktivität sichtbar in Form der kodierten Reporter-Protein. P-Element vermittelte Transgenese in der Fruchtfliege Drosophila Arten (D.) melanogaster 7 hat seit Jahrzehnten verwendet werden, um Reporter Transgene in diesem Modell Organismus einbringen, obwohl die genomische Anordnung der Transgene ist zufällig. Daher ist Reportergen-Aktivität stark von der lokalen Chromatinstruktur und Gen-Umwelt beeinflusst, die Begrenzung CRE Vergleiche werden qualitative. In den letzten Jahren wurde die phiC31 basierte Integration System für den Einsatz in D. melanogaster angepasst Transgene in spezifischen Genom Landeplätze 8-10 einfügen. Diese Fähigkeit hat die quantitative Messung der Gen hergestellt und hier relevant, CRE-Aktivität 11-13 feasible. Die Herstellung von transgenen Fruchtfliegen ausgelagert werden können, einschließlich phiC31-basierte Integration, wodurch die Notwendigkeit für teure Ausrüstung zu kaufen und / oder Kenntnisse in spezialisierten Transgen Injektion Protokolle.
Hier präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur quantitativen Auswertung eines CRE Tätigkeit und zeigen, wie dieser Ansatz verwendet werden, um die Auswirkungen einer Einführung Mutation auf einem CRE Tätigkeit zu messen und die Aktivitäten der orthologen CREs vergleichen. Obwohl die Beispiele für eine CRE aktiv sind während der Fruchtfliege Metamorphose, kann der Ansatz auf andere Entwicklungsstadien, Fruchtfliege Arten oder Modell-Organismen angewandt werden. Letztlich sollte eine breitere Anwendung dieser Methode zu untersuchen CREs Voraus ein Verständnis der regulatorischen Logik und wie Logik kann variieren und sich entwickeln.
Protocol
Discussion
cis-regulatorische Elemente kodieren die genomische Programm, das Genexpressionsmuster und damit den Prozess der Entwicklung 1 gibt, und sind prominente Standorte für beide Mutationen zugrunde liegende morphologische Evolution 2-4 und phänotypischen Variation für menschliche Züge 5,6,19. Trotz dieser großen Bedeutung sind die regulatorischen Logik für CREs wenig verstanden. Ein prominentes Grund dafür Verständnis Defizit ist der Mangel an geeigneten Methoden, um quantita…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken: Nicolas Gompel und Benjamin Prud'homme für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls; Melissa Williams und vier anonymen Gutachtern für Anmerkungen zum Manuskript; der University of Dayton Graduiertenschule für Forschungsstipendien an WAR, und der University of Dayton Biology Department und Research Institute (UDRI) für Forschungs-Unterstützung für TMW. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Stipendium 11BGIA7280000 zu TMW unterstützt.
Referências
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. . Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. , (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. . Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , (2007).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
