השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em
Summary
וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.
Abstract
דפוסי ביטוי גנים שצוינו על ידי cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט, אשר נקראים גם משפרי או cis-הרגולציה מודולים. Cre טיפוסי בעל הסדר של אתרי קישור מספר גורם שעתוק חלבונים המקנים היגיון הרגולציה לציין מתי, היכן, ובאיזה רמה את הגן מוסדר (ים) באה לידי ביטוי. סט מלא של צרס בתוך הגנום מקודד חיה בתוכנית של האורגניזם 1 עבור פיתוח, אמפירי, כמו גם מחקרים תיאורטיים מצביעים על כך מוטציות צרס שיחק תפקיד מרכזי באבולוציה מורפולוגית 2-4. יתר על כן, הגנום האנושי מחקרים רחב העמותה עולה כי שונות גנטית ב צרס לתרום באופן משמעותי כדי וריאציה פנוטיפי 5,6. לפיכך, הבנה הגיון הרגולציה וכיצד מוטציות להשפיע על לוגיקה כזו היא המטרה המרכזית של הגנטיקה.
Transgenes כתב לספק שיטה רבת עוצמה כדי לחקור את in vivo function של צרס. הנה רצף ידועים או חשודים Cre היא מצמידים את האמרגן Heterologous רצפים הגן המקודד כתב קידוד המוצר חלבון נצפות בקלות. כאשר כתב transgene מוכנס לתוך הפונדקאי, הפעילות של Cre הופך לגלוי בצורה של החלבון המקודד הכתב. P-אלמנט transgenesis בתיווך של זבוב הפירות מינים תסיסנית (ד ') melanogaster 7 שימש במשך עשרות שנים כדי להציג transgenes כתב לתוך אורגניזם מודל זה, למרות המיקום הגנומי של transgenes היא אקראית. לפיכך, פעילות הגן כתב מושפעת במידה רבה על ידי הכרומטין המקומית סביבת הגן, להגביל השוואות Cre כדי להיות איכותי. בשנים האחרונות, המערכת phiC31 אינטגרציה מבוסס הותאם לשימוש ד melanogaster להכניס לתוך transgenes ספציפי הנחיתה 8-10 הגנום אתרים. יכולת זו הפכה את מדידה כמותית של גנים, רלוונטי כאן, cre 11-13 פעילות המוקדasible. הייצור של זבובי פירות מהונדס יכול להיות במיקור חוץ, כולל אינטגרציה phiC31 מבוססות, ומבטל את הצורך לרכוש ציוד יקר ו / או מיומנות מיוחדת פרוטוקולי transgene ההזרקה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כללית כמותית ולהעריך פעילות של cre, ולהראות כיצד גישה זו ניתן להשתמש כדי למדוד את ההשפעות של מוטציה הציג על פעילות של Cre ולהשוות את פעילותם של צרס orthologous. למרות הדוגמאות הן עבור פעיל Cre במהלך המטמורפוזה זבוב הפירות, הגישה יכול להיות מיושם על שלבי התפתחות אחרים, לטוס מינים פירות, או אורגניזמים מודל. בסופו של דבר, השימוש הנרחב יותר של גישה זו צרס המחקר צריך לקדם הבנה של הלוגיקה הרגולציה ואיך ההיגיון יכול להשתנות ולהתפתח.
Protocol
Discussion
cis-הרגולציה אלמנטים לקודד את התוכנית גנומית המציין דפוסי ביטוי גנים ועל ידי כך את תהליך הפיתוח 1, הם מקומות בולטים הן מוטציות הבסיסית באבולוציה מורפולוגית 2-4 ו וריאציה פנוטיפי עבור תכונות אנושיות 5,6,19. למרות חשיבות זו, ההיגיון הרגולציה צרס להישא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים: ניקולא Gompel ובנימין Prud'homme על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה; מליסה וויליאמס וארבעה בודקים אנונימי הערות על כתב היד; של אוניברסיטת דייטון בוגר בית הספר עבור מלגות מחקר מלחמה; של אוניברסיטת דייטון ביולוגיה מחלקת מכון המחקר (UDRI) תמיכה מחקר TMW. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11BGIA7280000 כדי TMW.
Referências
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. . Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. , (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. . Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , (2007).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
