Kvantitative Sammenligning av Cis-Regulatory Element (CRE) Aktiviteter i Transgen Drosophila melanogaster</em
Summary
Fenotypisk variasjon for trekk kan skyldes mutasjoner i cis-regulerende element (CRE) sekvenser som kontrollerer genuttrykk mønstre. Metoder utledet for bruk i Drosophila melanogaster kan kvantitativt sammenligne nivåene av romlige og tidsmessige mønstre av genuttrykk mediert av modifisert eller naturlig forekommende CRE varianter.
Abstract
Genuttrykk mønstre er spesifisert av cis-regulatoriske element (CRE) sekvenser, som også kalles enhancers eller cis-regulatoriske moduler. En typisk CRE besitter et arrangement av bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer proteiner som gir en regulerende logikk spesifisere når, hvor og på hvilket nivå det regulerte genet (e) er uttrykt. Det fulle settet med Cres innenfor et dyr genome koder organismens program for pt utvikling, og empirisk så vel som teoretiske studier tyder på at mutasjoner i Cres spilt en fremtredende rolle i morfologiske utviklingen 2-4. Videre menneskelige genom bred sammenslutning studier indikerer bidra at genetisk variasjon i Cres vesentlig til fenotypisk variasjon 5,6. Dermed forståelse regulatoriske logikk og hvordan mutasjoner påvirker en slik logikk er et sentralt mål av genetikk.
Reporter transgener gir en kraftfull metode for å studere in vivo funksjosjon av Cres. Her er en kjent eller mistenkt CRE sekvensen er koblet til heterologe arrangøren og koding sekvenser for en reporter genet som koder en lett observerbare protein produktet. Når en reporter transgenet settes inn i en vertsorganisme, blir CRE aktivitet synlig i form av kodede reporter protein. P-element mediert transgenesis i bananflue arten Drosophila (D.) melanogaster 7 har blitt brukt i flere tiår å introdusere reporter transgener inn i denne modellen organisme, men genomiske plassering av transgener er tilfeldig. Derfor er reporter genaktivitet sterkt påvirket av lokale kromatin og gen miljøet ved å begrense CRE sammenligninger til å være kvalitative. I de senere årene, ble phiC31 basert integrasjon system tilpasset for bruk i D. melanogaster å sette transgener inn spesifikke genome landingssteder 8-10. Denne evnen har gjort kvantitativ måling av genet, og relevant her, CRE aktivitet 11-13 feasible. Produksjonen av transgene bananfluer kan outsources, inkludert phiC31-basert integrasjon, eliminerer behovet for å kjøpe dyrt utstyr og / eller har kompetanse på spesialiserte transgenet injeksjon protokoller.
Her presenterer vi en generell protokoll for å kvantitativt vurdere en CRE aktivitet, og vise hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å måle effekten av en introdusert mutasjon på en CRE aktivitet og å sammenligne aktivitetene orthologous Cres. Selv om eksemplene gitt er for en CRE aktive under bananflue metamorfose, kan tilnærmingen brukes til andre utviklingsstadier, bananflue arter, eller modell organismer. Til syvende og sist, bør en mer utbredt bruk av denne tilnærmingen å studere Cres fremme en forståelse av regulerende logikk og hvordan logikk kan variere og utvikle seg.
Protocol
Discussion
cis-regulatoriske elementer kode genomisk program som angir genuttrykk mønstre og dermed prosessen med utviklingen 1, og er fremstående steder for både mutasjoner underliggende morfologiske utviklingen 2-4 og fenotypisk variasjon for menneskelige trekk 5,6,19. På tross av denne betydning, forblir det regulatoriske logikk for Cres dårlig forstått. En fremtredende årsak til denne forståelsen underskuddet har vært mangel på egnede metoder for å kvantitativt sammenlikne f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker: Nicolas Gompel og Benjamin Prud'homme for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen, Melissa Williams og fire anonyme anmeldere for kommentarer til manuskriptet, University of Dayton Graduate School for stipendiatstillinger til krig, og University of Dayton Biology avdeling og Research Institute (UDRI) for forskningsstøtte til TMW. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 11BGIA7280000 til TMW.
Referências
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. . Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. , (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. . Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , (2007).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
