Kvantitativ jämförelse av Cis-Regulatory Element (CRE) Aktiviteter i transgena Drosophila melanogaster</em

Summary

Fenotypiska variation för egenskaper kan bero på mutationer i cis-reglerande element (CRE) sekvenser som styr genuttryck mönster. Metoder härrör för användning i Drosophila melanogaster kan kvantitativt jämföra nivåer av rumsliga och tidsmässiga mönster av genuttryck medieras av ändrat eller naturligt förekommande CRE varianter.

Abstract

Gene expression patterns specificeras av cis-reglerande element (CRE) sekvenser, som också kallas smakförstärkare eller cis-reglerande moduler. En typisk CRE besitter ett arrangemang av bindningsställen för flera proteiner transkriptionsfaktor som ger ett regelverk logik som anger när, var och på vilken nivå de reglerade gen (er) uttrycks. Den fullständiga uppsättningen CRES inom ett djur arvsmassa kodar organismens program för utveckling ^1, och empiriska samt teoretiska studier tyder på att mutationer i Cres spelade en framträdande roll i morfologisk evolution ^2-4. Dessutom mänskliga genomet hela föreningen studier tyder på att genetisk variation i Cres bidra avsevärt till fenotypisk variation ^5,6. Således, förståelse regelverk logik och hur mutationer påverkar en sådan logik är ett centralt mål för genetik.

Reporter transgener ger en kraftfull metod för att studera in vivo-funktionenning av Cres. Här en känd eller misstänkt CRE sekvens är kopplad till heterologa promotorn och kodning sekvenser för en reporter som kodar för ett lätt observerbara protein produkt. När en reporter transgen sätts in i en värdorganism blir CRE verksamhet synlig i form av kodade reporter protein. P-element medierad genmodifiering i bananfluga arten Drosophila (D.) melanogaster ⁷ har använts i årtionden att införa reporter transgener i denna modell organism, även om genomiska placering av transgener är slumpmässig. Därför är reporter genaktivitet starkt influerad av den lokala kromatin och gen miljön, och begränsar CRE jämförelser att vara kvalitativa. På senare år var phiC31 baserad integration system anpassat för användning i D. melanogaster att infoga transgener till specifika platser genomet landning ^8-10. Denna förmåga har gjort kvantitativa mätningar av genen och relevant här, CRE aktivitet ^11-13 feasible. Produktionen av transgena fruktflugor kan läggas ut på entreprenad, inklusive phiC31-baserad integration, vilket eliminerar behovet av att köpa dyr utrustning och / eller har kunskaper på specialiserade transgenen injektion protokoll.

Här presenterar vi ett generellt protokoll för att kvantitativt utvärdera en CRE verksamhet, och visa hur denna metod kan användas för att mäta effekterna av en introducerad mutation på en CRE verksamhet och att jämföra verksamhet orthologous Cres. Även om de exempel som ges är för en CRE aktiva under bananfluga metamorfos, kan det tillvägagångssätt kunna tillämpas på andra utvecklingsstadier, frukt arter flyga eller organismer modell. Slutligen bör en mer utbredd användning av denna metod för att studera Cres främja en förståelse för reglerande logik och hur logiken kan variera och utvecklas.

Protocol

Översikt: Denna video visar ett protokoll som kan kvantitativt mäta genen reglerande aktiviteter för cis-reglerande element (CRE) sekvenser i Drosophila (D.) melanogaster. Detta protokoll kan användas för att jämföra med regelverket besatt av: vildtyp och mutant CRE former, naturligt CRE alleler finns inom en art, eller orthologous Cres mellan avvikit arter. 1. Platsspecifika integration av reporter transgener i Drosophila melanogaster genomet…

Discussion

cis-reglerande element koda arvsmassans programmet som anger mönster genuttryck och därmed utvecklingsprocessen ¹ och är framträdande platser för både mutationer underliggande morfologiska evolutionen ^2-4 och fenotypisk variation för mänskliga drag ^5,6,19. Trots detta betydelse, förblir den rättsliga logiken för Cres dåligt kända. En framträdande orsak till denna insikt underskottet har varit bristen på lämpliga metoder för att kvantitativt jämföra funktionell…