Summary

Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

Published: November 01, 2011
doi:

Summary

O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.

Abstract

Vírus da febre Rift Valley (RVFV), que causa febre hemorrágica, distúrbios neurológicos ou cegueira em humanos, e uma alta taxa de aborto e malformação fetal em ruminantes 1, foi classificado como um HHS / USDA sobreposição agente selecionado e um grupo de risco 3 patógeno. Pertence à Phlebovírus gênero no Bunyaviridae família e é um dos membros mais virulenta dessa família. Vários sistemas de genética reversa para a cepa vacinal MP-12 RVFV 2,3, bem como cepas do tipo selvagem RVFV 4-6, incluindo ZH548 e ZH501, têm sido desenvolvidos desde 2006. O MP-12 estirpe (que é um grupo de risco 2 patógeno e um agente não-select) é altamente atenuada por várias mutações em seu M e L-segmentos, mas ainda carrega virulenta segmento S-RNA 3, que codifica uma virulência funcional NSS fator. O rMP12-C13type (C13type) transportando 69% em-frame de eliminação do NSS ORF não tem todas as funções NSS conhecida, enquanto ele replica como effictário como faz MP-12 em células VeroE6 faltando tipo I IFN. NSS induz um shut-off de transcrição de hospedeiros, incluindo interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 e promove a degradação de double-stranded RNA-proteína quinase dependente (PKR) em nível de pós-translacionais. 9,10 IFN-beta é transcricionalmente upregulated por interferon fator de regulação 3 (IRF-3), NF-kB e proteína ativadora-1 (AP-1), ea ligação do IFN-beta para IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula a transcrição de IFN-alpha genes ou de outros genes interferon estimulada (ISGs) 11, que induz actividades de acolhimento antiviral, ao passo que a supressão anfitrião de transcrição incluindo IFN-beta gene pela NSS impede que o gene upregulations daqueles ISGs em resposta a replicação viral, embora IRF-3, NF-kB e ativador proteína-1 (AP-1) pode ser ativado por RVFV7. . Assim, o NSS é um excelente alvo para continuar a atenuar MP-12, e para melhorar a resposta imune inata anfitrião, abolindo a função de supressão de IFN-beta. Aqui, Nós descrevemos um protocolo para a geração de um recombinante MP-12 NSS codificação mutado, e fornecer um exemplo de um método de triagem para identificar mutantes NSS falta a função de suprimir a síntese de IFN-beta mRNA. Além de seu papel essencial na imunidade inata, tipo I IFN é importante para a maturação das células dendríticas e indução de uma resposta imune adaptativa 12-14. Assim, os mutantes NSS induzindo tipo I IFN são mais atenuadas, mas ao mesmo tempo, são mais eficientes na resposta do hospedeiro estimulante imunológico do tipo selvagem MP-12, o que os torna candidatos ideais para abordagens de vacinação.

Protocol

1. Recuperação de recombinantes mutação NSS MP-12 codificação (s) de DNAs plasmídeo 2 Spread rim de hamster bebé (BHK) / T7-9 células 15, que expressa estavelmente T7 RNA polimerase, em 6 cm de pratos em Meio Essencial Mínimo (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32561037) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS ), penicilina-estreptomicina (Penicilina: 100 U / ml Estreptomicina: 100 mcg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), e 600 mg / ml de higromicina B (Cellgro, Cat # 30-240-CR). <br /…

Discussion

Genética reversa de sistemas para RVFV foram desenvolvidos por vários grupos, utilizando T7 promoter 2,4,5 ou mouse de 3 ou 4 humanos promotor pol-I. Neste manuscrito, nós descrevemos um protocolo para gerar recombinantes RVFV MP-12 linhagens de células usando BHK/T7-9 15 que expressa estavelmente T7 RNA polimerase. A eficiência de recuperação viral variava de acordo com a condição de BHK/T7-9 células, a quantidade de plasmídeos, o número de células transfectadas …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Grant Number 5 U54 AI057156-07 através do Centro Regional de Excelência Ocidental (WRCE), um R01 AI08764301-A1 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, e um financiamento interno do Sealy Center for Vaccine Development da Universidade de Texas Medical Branch.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  

Referências

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).

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