Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato
Summary
L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.
Abstract
L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chemosensoriali che portano informazioni sullo stato sociale, sessuale e riproduttiva degli individui all'interno della stessa specie, 1,2. Questi segnali intraspecie, i feromoni, così come i segnali di alcuni predatori 3, attivare i neuroni sensoriali vomeronasale (VSNs) con alti livelli di specificità e sensibilità 4. Almeno tre distinte famiglie di proteine G recettori accoppiati, V1R, V2R e FPR 5-14, vengono espressi nei neuroni VNO di mediare la rilevazione della spunti chemosensoriali. Per capire come le informazioni feromone è codificata dal VNO, è fondamentale per analizzare i profili di risposta di VSNs individuale a stimoli diversi e identificare i recettori specifici che mediano la risposta.
Il neuroepithelia di VNO sono racchiusi in un paio di ossa vomere. Il semi-cieco struttura tubolare del VNO ha una estremità aperta (il dotto vomeronasale) che collega ala cavità nasale. VSNs estendere i loro dendriti alla parte lume del VNO, dove gli spunti feromoni sono in contatto con i recettori espressi al manopole dendritiche. I corpi cellulari dei VSNs forma pseudo-stratificato con strati V1R e V2R espressa negli strati basali e apicali rispettivamente 6-8. Diverse tecniche sono state utilizzate per monitorare le risposte di VSNs agli stimoli sensoriali 4,12,15-19. Tra queste tecniche, la preparazione fetta acuta offre diversi vantaggi. In primo luogo, rispetto ai 3,17 VSNs dissociato, preparati fetta mantenere i neuroni nella loro morfologia e origine i dendriti delle cellule soggiorno relativamente intatte. In secondo luogo, i corpi cellulari dei VSNs sono facilmente accessibili in fetta coronale del VNO per consentire studi di elettrofisiologia ed esperimenti di imaging rispetto a epitelio tutto e tutto di montaggio preparati 12,20. In terzo luogo, questo metodo può essere combinata con tecniche di clonazione molecolare per consentire l'identificazione del recettore.
Stimolazione sensoriale suscita forte afflusso Ca 2 + in VSNs che è indicativo di attivazione dei recettori 4,21. Abbiamo così sviluppare topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nei neuroni sensoriali olfattivi, compreso il VSNs 15,22. La sensibilità e la natura genetica della sonda facilitare notevolmente Ca 2 + esperimenti di imaging. Questo metodo ha eliminato il processo di tintura di carico utilizzati in studi precedenti 4,21. Inoltre utilizzano un sistema di consegna ligando che consente l'applicazione di stimoli diversi per le fette VNO. La combinazione delle due tecniche ci permette di monitorare contemporaneamente i neuroni in risposta a un gran numero di stimoli. Infine, abbiamo stabilito un semi-automatico pipeline di analisi per aiutare l'elaborazione delle immagini.
Protocol
Discussion
La maggior parte dei recettori vomeronasale (VR) rimangono come recettori orfano fin dalla loro scoperta da parte Dulac e Axel 5. I ligandi feromone per questi recettori chemosensoriali e il loro ruolo nel mediare i comportamenti animali non sono ben compresi. Fino ad ora, solo un paio di ligando / recettore, il ESP1 peptide e il suo recettore, Vmn2r116 (V2Rp5), è stato identificato e indicato per trasmettere informazioni specifiche sociale 19,23. Un altro recettore, V1rb2, ha dimostrato di rispon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Andrea Moran insieme con i membri del Centro di Assistenza Animal Lab (LASF) a Stowers Institute per il loro supporto eccellente per la zootecnia e dei servizi tecnici. Questo lavoro è supportato da un finanziamento Stowers Institute e il NIH (dell'NIDCD 008.003) a piangere. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione o il National Institutes of Health. Usa in attesa di brevetto per il Teto-G-CaMP2 topi per Stowers Institute, CRY e LM.
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