Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET
Summary
FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.
Abstract
Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerde verslaggevers 1 laat de beoordeling van de endogene kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen. Dergelijke sondes bestaan gewoonlijk uit van varianten van het GVB en YFP, ingegrepen door een fosforyleerbare volgorde en een fosfo-bindend domein. Bij fosforylering, de sonde verandert conformatie, hetgeen resulteert in een verandering van de afstand of oriëntatie tussen het GVB en YFP, wat leidt tot een verandering in de FRET efficiëntie (afb. 1). Verschillende sondes zijn gepubliceerd in het laatste decennium, het toezicht op de activiteit saldo van meerdere kinases en fosfatasen, waaronder verslaggevers van PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 en Plk1 9 . Gezien de modulaire ontwerp, extra sondes waarschijnlijk ontstaan in de nabije toekomst 10.
Voortgang door de celcyclus wordt beïnvloed door stress signaling paden 11. Met name, is de celcyclus en gemeente verschillend geregeld tijdens onverstoord de groei in vergelijking met wanneer de cellen zich herstellen van stress 12. Time-lapse beeldvorming van cellen door de celcyclus dan ook bijzondere voorzichtigheid vereist. Dit wordt een probleem, vooral wanneer zij een beroep ratiometrische imaging, aangezien twee beelden met een hoge signaal-ruisverhouding nodig zijn om correct te interpreteren de resultaten. Ratiometrische FRET beeldvorming van celcyclus afhankelijke veranderingen in kinase en fosfatase activiteiten is voornamelijk beperkt tot sub-secties van de celcyclus 8,9,13,14.
Hier bespreken we een methode om FRET-gebaseerde probes met ratiometrische beeldvorming in de gehele menselijke cel-cyclus te volgen. De methode is gebaseerd op materiaal dat beschikbaar is voor veel onderzoekers in life sciences en vereist geen specialistische kennis van microscopie of beeldverwerking.
Protocol
Discussion
Monitoring FRET gedurende de celcyclus vereist overwegingen die minder belangrijk bij de beoordeling van de korte termijn reacties op prikkels van buitenaf. Ten eerste is celcyclusprogressie gemakkelijk verstoord door stress signaleren, te verlangen dat fototoxiciteit is tot een minimum beperkt. Ten tweede, kunnen alle reporters potentieel van invloed op cellulaire processen door titratie van kinasen, fosfatasen of interactie domeinen. De waarschijnlijk meest eenvoudige manier om te beoordelen of de experimentele omstan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs worden ondersteund door de Zweedse onderzoeksraad, de Zweedse stichting voor strategisch onderzoek, de Zweedse Cancer Society, de Zweedse kind Cancer Society, Åke Wibergs fundering en Jeanssons stichting.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
Referências
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
