ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג
Summary
סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.
Abstract
פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים 1 לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של 2 PKA, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, אורורה B 9 ו 9 Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב 10 בעתיד הקרוב.
התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling 11 מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח 12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא 8,9,13,14.
כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.
Protocol
Discussion
ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או ת?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים נתמכים על ידי המועצה למחקר השוודי, הבסיס שוודית למחקר אסטרטגי, החברה השוודית סרטן, החברה השוודית סרטן ילדים, האייק Wibergs הקרן Jeanssons הקרן.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
Referências
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
