Övervakning Kinase och fosfatas verksamhet genom cellcykeln genom Propportionell FRET
Summary
FRET-baserade journalister alltmer används för att övervaka kinas och fosfatas aktiviteter i levande celler. Här beskriver vi en metod på hur man använder FRET-baserade reportrar att bedöma cellcykeln-beroende förändringar i målet fosforylering.
Abstract
Förster resonans energy transfer (FRET)-baserade reportrar 1 medger en bedömning av endogena kinas och aktiviteter fosfatas i levande celler. Sådana givare består i regel av varianter av GFP och YFP ingrep genom en phosphorylatable sekvens och en fosfor-bindande domän. Vid fosforylering, sonden förändringar konformation, vilket resulterar i en förändring av avståndet eller orienteringen mellan fiskeripolitiken och YFP, vilket leder till en förändring i FRET effektivitet (Fig. 1). Flera givare har publicerats under det senaste decenniet, övervaka verksamheten balans av flera kinaser och fosfataser, däribland reportrar på PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 och Plk1 9 . Med tanke på den modulära design, fler sonder kommer sannolikt att dyka upp inom en snar framtid 10.
Progression genom cellcykeln påverkas av stress signaling vägar 11. Noterbart är cellcykeln regleras annorlunda under oberörd tillväxt jämfört med när celler återhämtar sig från stress 12. Time-lapse avbildning av celler genom cellcykeln kräver därför särskild försiktighet. Detta blir ett problem särskilt vid anställning ratiometrisk bildbehandling, eftersom två bilder med en hög signal-brus-förhållande som krävs för att korrekt tolka resultaten. Ratiometrisk FRET avbildning av beroende cellcykelns förändringar i kinas och fosfatas verksamheten huvudsakligen har begränsats till underavdelningar av cellcykeln 8,9,13,14.
Här diskuterar vi en metod för att övervaka FRET-baserade prober med ratiometrisk avbildning hela den mänskliga cellcykeln. Metoden bygger på utrustning som är tillgänglig för många forskare inom biovetenskap och inte kräver expertkunskaper om mikroskopi eller bildbehandling.
Protocol
Discussion
Övervakning FRET hela cellcykeln kräver överväganden som är mindre viktiga vid bedömningen av kortsiktiga reaktioner på yttre stimuli. För det första är cellcykelreglering lätt störd av stress signalering, som kräver att fototoxicitet hålls till ett minimum. För det andra kan alla reportrar påverka potentiellt cellulära processer genom att titrera ut kinaser, fosfataser eller domäner interaktion. Det förmodligen enklaste sättet att bedöma om de experimentella förutsättningarna är tillräckliga ä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna stöds av det svenska Vetenskapsrådet, svenska Stiftelsen för strategisk forskning, svenska Cancerfonden, Svensk barncancer samhället, Åke Wibergs stiftelse och Jeanssons stiftelse.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
Referências
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
