Live-cell imaging af caspase-3 medieret apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte cellekulturer ved hjælp af<em> NucView</em> 488 caspase-3 substrat. Denne teknik kan anvendes til programmeret celledød assays i real-tid i en række forskellige celletyper og væv.
Det centrale nervesystem kan opleve en række af spændinger og neurologiske fornærmelser, som kan have mange skadelige virkninger, der i sidste ende føre til en reduktion i neuronal befolkning og funktion. Beskadigede axoner kan frigive excitatoriske molekyler herunder kalium eller glutamat i den ekstracellulære matrix, som igen kan producere yderligere fornærmelse og skade for støtte gliaceller herunder astrocytter og oligodendrocytes 8, 16. Hvis fornærmelse fortsætter, vil cellerne undergår programmeret celledød (apoptose), som er reguleret og aktiveres af en række veletablerede signaltransduktion kaskader 14. Apoptose og vævsnekrose kan opstå efter traumatisk hjerneskade, cerebral iskæmi, og beslaglæggelser. Et klassisk eksempel på apoptotiske regulering er den familie af cystein-afhængige aspartat-rettet proteaser, eller caspases. Aktiveret proteaser herunder caspases har også været impliceret i celledød i reaktion på kronisk neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers, Huntingtons, og dissemineret sklerose 4, 14, 3, 11, 7.
I denne protokol beskriver vi brugen af NucView 488 caspase-3 substrat til at måle hastigheden af caspase-3 medieret apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte (OLG) cellekulturer 15, 5, efter eksponering til forskellige ekstracellulære understreger, såsom høje koncentrationer af kalium eller glutamat. Af en betinget-udødeliggjort N19-OLG cellelinie (der repræsenterer O2A stamfader) er indhentet fra Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, og tidligere har været brugt til at studere molekylære mekanismer af myelin genekspression og signal transduktion førende til OLG differentiering (fx 6, 10). Vi har fundet denne cellelinie at være robust i forhold til transfektion med eksogene myelin grundlæggende protein (MBP) konstruerer smeltet til enten RFP eller GFP (rød eller grøn fluorescerende protein) 13,12. Her blev N19-OLG cellekulturer behandlet med enten 80 mm kaliumklorid eller 100 mm natriumglutamat at efterligne aksonal lækage i den ekstracellulære matrix til at inducere apoptose 9. Vi brugte en bi-funktionelle caspase-3 substrat, der indeholder en DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 anerkendelse subunit og en DNA-bindende dye 2. Underlaget hurtigt kommer ind i cytoplasma, hvor det er kløves af intracellulær caspase-3. Farvestoffet, NucView 488 er frigivet, og kommer ind i cellekernen, hvor det binder DNA og fluorescerer grønt ved 488 nm, signalering apoptose. Brug af NucView 488 caspase-3 substrat giver mulighed for live-cell imaging i real-tid 1, 10. I denne video, vi også beskriver dyrkning og transfektion af udødeliggjort N19-OLG celler, såvel som live-cell imaging teknikker.
Selv om dette ikke er den eneste fluorogenic produkt til rådighed for apoptose detektion, er der flere væsentlige fordele ved at bruge NucView 488 underlaget. En af de vigtigste fordele er evnen til at følge apoptose i levende celler i realtid, mens de fleste alternative produkter enten kræver cellelysis eller har dårlig celle permeabilitet. Andre fordele omfatter høj følsomhed for caspase-3 anerkendelse, høj celle permeabilitet, lav cytotoksicitet, og ingen indblanding i udviklingen af apoptose. Underlaget har også lav baggrundsfluorescens, indtil det er kløvet, og ind i kernen, hvilket eliminerer baggrundsfluorescens. Den caspase-3 anerkendelse sekvens indeholder 3 negative ladninger og DNA-bindende farvestof har en positiv ladning 2. Den DEVD-NucView 488 molekylet har således en netto negativ ladning, som forhindrer aktivering og binding af farvestoffet til DNA i celler, hvor caspase ikke er aktiv.
Maintaining sammenhæng mellem forsøgene er forpligtet til at kunne drage meningsfulde sammenligninger mellem replikater. En af de vigtigste parametre for at holde konsekvent er celle tæthed, da det påvirker antallet af transfektion. Indhentning af høje transfektion satser i udødeliggjort N19-OLG cellekulturer er sværere end med andre fælles cellelinjer såsom HeLa eller HEK293, og er meget afhængig af tæthed, i vores erfaring 12, 13. Vores bedste transfektion effektivitet for disse celler er blevet opnået med Fugene HD (Roche) og er normalt omkring 15%, men kan nå op over 30%, afhængig af konstruktion. Omhyggelig celletælling vil hjælpe med at opnå konsekvent transfektion satser. Det er også vigtigt at udsætte celler fra forskellige behandlinger til samme grad af miljøbelastninger, især når man måler satser for apoptose. Konkret, hvor lang tid, over hvilken cellerne udsættes for transfektion reagenser, eller mængden af lys eksponering, er vigtige miljø-variabelhavender til at overveje, og det bør forblive konstant på tværs af eksperimenter. For vores applikationer, har vi fundet, at indsamling af en lang række områder-of-view giver en tilstrækkelig stor stikprøvestørrelse til at foretage statistisk signifikante sammenligninger [ibid.].
The authors have nothing to disclose.
Dette laboratorium er blevet støttet af den canadiske Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, og Scleroseforeningen i Canada (MSSC). GSTS var modtageren af en ph.d.-Studentship fra MSSC. Vi er taknemmelige for Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) til mange nyttige diskussioner og kommentarer til dette manuskript. Vi er taknemmelige for Biotium for deres generøse gave af yderligere NucView 488 caspase-3.
Table of specific reagents and equipment
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
---|---|---|
NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
#1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |