Live-cell imaging av caspase-3 mediert apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte cellekulturer med<em> NucView</em> 488 caspase-3 substrat. Denne teknikken er aktuelt for programmert celledød essay i sanntid i en rekke celletyper og vev.
Det sentrale nervesystemet kan oppleve en rekke påkjenninger og nevrologiske fornærmelser, som kan ha en rekke negative effekter som til slutt fører til en reduksjon i neuronal befolkning og funksjon. Skadede axons kan slippe eksitatoriske molekyler, inkludert kalium eller glutamat i ekstracellulær matrix, som igjen kan produsere ytterligere fornærmelse og skade på støtte glial celler, inkludert astrocytes og oligodendrocytes 8, 16. Hvis fornærmelse vedvarer, vil celler gjennomgå programmert celledød (apoptose), som er regulert og aktiveres av en rekke godt etablerte signal transduksjon kaskader 14. Apoptose og vevsnekrose kan oppstå etter traumatisk hjerneskade, cerebral iskemi, og beslag. Et klassisk eksempel av apoptotiske regulering er familien til cystein-avhengige aspartat-rettet proteaser eller caspases. Aktivert proteaser inkludert caspases har også vært innblandet i celledød i respons til kronisk nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Huntingtons, og Multippel sklerose 4, 14, 3, 11, 7.
I denne protokollen beskriver vi bruk av NucView 488 caspase-3 substrat å måle frekvensen av caspase-3 mediert apoptose i udødeliggjort N19-oligodendrocyte (OLG) cellekulturer 15, 5, etter eksponering for ulike ekstracellulære påkjenninger som for eksempel høye konsentrasjoner av kalium eller glutamat. Den betinget-udødeliggjort N19-OLG cellelinje (representerer O2a stamfar) ble hentet fra Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, og har tidligere blitt brukt til å studere molekylære mekanismer av myelin genuttrykk og signaltransduksjon ledende til OLG differensiering (6 f.eks, 10). Vi har funnet denne cellelinje til å være robust med hensyn til transfeksjon med eksogen myelin grunnleggende protein (MBP) konstruerer smeltet sammen til enten RFP eller GFP (rød eller grønn fluorescerende protein) 13,12. Her ble N19-OLG cellekulturer behandlet med enten 80 mm kaliumklorid eller 100 mm natrium glutamat å etterligne aksonal lekkasje inn i ekstracellulære matrix å indusere apoptose 9. Vi brukte en bi-funksjonell caspase-3 substrat som inneholder en devd (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 anerkjennelse subenheten og et DNA-bindende dye 2. Underlaget går fort cytoplasma der det spaltes av intracellulære caspase-3. Fargestoff, 488 NucView frigjøres og kommer inn i cellekjernen der det binder DNA og fluoresces grønt ved 488 nm, signalering apoptose. Bruk av NucView 488 caspase-3 substrat muliggjør for live-cell imaging i sanntid 1, 10. I denne videoen, vi også beskrive dyrking og transfeksjon av udødeliggjort N19-OLG celler, samt live-cell imaging teknikker.
Selv om dette er ikke den eneste fluorogenic produktet tilgjengelig for apoptose deteksjon, er det flere betydelige fordeler med å bruke den NucView 488 underlaget. En av de største fordelene er muligheten til å følge apoptose i levende celler i sanntid, mens de fleste alternative produkter enten krever cellelyse eller har dårlig celle permeabilitet. Andre fordeler er høy følsomhet for caspase-3 anerkjennelse, høy celle permeabilitet, lav cytotoksisitet, og ingen forstyrrelser med utviklingen av apoptose. Underlaget har også lav bakgrunnsfluorescens til den er spaltes og kommer inn i kjernen, noe som eliminerer bakgrunnsfluorescens. Den caspase-3 gjenkjennelse sekvens inneholder 3 negative kostnader og DNA-bindende fargestoff har en positiv ladning 2. Den devd-NucView 488 molekyl har dermed en netto negativ ladning, noe som hindrer aktivering og binding av fargestoff til DNA i cellene der caspase er ikke aktiv.
Maintaining konsistens mellom eksperimenter er nødvendig for å kunne trekke meningsfulle sammenligninger mellom replikater. En av de viktigste parametrene for å holde konsekvent er celle tetthet, da det påvirker frekvensen av transfeksjon. Innhenting av høy transfeksjon priser i udødeliggjort N19-OLG cellekulturer er vanskeligere enn med andre vanlige cellelinjer som Hela eller HEK293, og er svært avhengig av tetthet, i vår erfaring 12, 13. Våre beste transfeksjon effektivitet for disse cellene har blitt oppnådd med Fugene HD (Roche) og er normalt ca 15%, men kan nå over 30%, avhengig av konstruksjon. Nøye celle telle skal hjelpe til med å skaffe konsekvent transfeksjon priser. Det er også viktig å eksponere cellene fra forskjellige behandlinger til samme grad av miljømessig stress, spesielt når man måler forekomst av apoptose. Konkret hvor lang tid over hvor cellene blir utsatt for transfeksjon reagenser, eller mengden av lyseksponering, er viktige miljømessige Variables å vurdere, og bør forbli konstant på tvers av eksperimenter. For våre applikasjoner, har vi funnet ut at å samle et stort antall felt-of-view gir en tilstrekkelig stor sample size for å gjøre statistisk signifikant sammenligninger [ibid].
The authors have nothing to disclose.
Dette laboratoriet har vært støttet av den kanadiske Institutes of Health Research, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, og multippel sklerose Society of Canada (MSSC). GSTS var mottakeren av en Doctoral Studentship fra MSSC. Vi er takknemlige til Dr. Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) for mange nyttige diskusjoner og kommentarer på dette manuskriptet. Vi er takknemlige for å Biotium for sin generøse gave av ekstra NucView 488 caspase-3.
Table of specific reagents and equipment
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
---|---|---|
NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
#1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |