Transretinal ERG Inspelningar från mus Retina: Stång och Photoresponses Cone
Summary
Vi beskriver en relativt enkel metod för transretinal elektroretinogram (ERG) inspelningar för att erhålla stav-och-kon photoresponses från intakt mus näthinnan. Denna strategi tar fördel av blocket av synaptisk överföring från fotoreceptorer för att isolera sina ljus svar och spela dem med fältelektroder placerade över isolerade flat-monterade näthinnan.
Abstract
Det finns två distinkta klasser av bildalstrande fotoreceptorer i ryggradsdjuret näthinnan: stavar och tappar. Stänger kan upptäcka enstaka fotoner av ljus medan tappar arbeta kontinuerligt under föränderliga ljusa ljusförhållanden. Absorption av ljus genom stav-och kon-specifika visuella pigment i de yttre segmenten av fotoreceptorer utlöser en ljusöverledningen kaskad som slutligen leder till stängning av cykliska nukleotid-gated kanaler på plasmamembranet och cell hyperpolarisering. Detta ljus-inducerad förändring i membranet nuvarande och potentiella kan registreras som ett fotoresponsen, antingen genom klassiska sugelektrod inspelningsteknik 1,2 eller transretinal elektroretinogram inspelningar (ERG) från isolerade näthinnor med farmakologiskt blockerade postsynaptiska svar komponenter 3-5. Den senare metoden kan läkemedelsinnehållande tillgängliga långvariga inspelningar från mus fotoreceptorer och är särskilt användbar för att erhålla stabila photoresponses frOM de knappa och sköra mus kottar. I fallet med kottar, kan sådana experiment utföras både i mörk-anpassade förhållanden och efter intensiva belysning som bleker i huvudsak alla synliga pigment, för att övervaka den konen ljuskänslighet återhämtning under mörka anpassning 6,7. I den här filmen kommer vi att visa hur man utför stav-och M / L-kon-drivna transretinal inspelningar från mörkt anpassad mus näthinnan. Stången inspelningar kommer att utföras med användning av näthinnan av vildtyp (C57BL / 6) möss. För enkelhets skull kommer kon inspelningar erhållas från genetiskt modifierade stav transducin α-subenheten knockout (Tai – / -) möss som saknar stången signalering 8.
Protocol
Discussion
Metoden för stav-och kon-drivna transretinal ERG inspelningar som beskrivs ovan blir ett kraftfullt verktyg för att undersöka funktionen av mus fotoreceptorer i både vildtyp och genetiskt modifierade djur. Förutom den enkla karakterisering av grundläggande fotoresponsen egenskaper ger denna enkla teknik stort gensvar stabilitet under långvariga experiment som utförts på ett nära-till-intakta näthinnan preparat. Både mörka anpassad stav maximal respons amplitud och ljuskänslighet i vildtypmöss är stabila …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av Career Development Award från Forskning kring att förebygga blindhet, NIH bidrag EY19312 och EY19543 (VJK), liksom av obegränsad bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet och EY02687 (Ögonkliniken och Visual Sciences vid Washington University).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
Referências
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
