Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen
Summary
Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.
Abstract
Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik 1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten 3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation 6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung 8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout (- / – Tα) erhalten werden
Protocol
Discussion
Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfind…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt von Career Development Award von der Forschung zur Erblindung zu verhindern, NIH Zuschüsse EY19312 und EY19543 (VJK), sowie durch nicht zweckgebundenen Zuschuss von Forschung zur Erblindung und EY02687 (Klinik für Augenheilkunde und Visual Sciences an der Washington University) zu verhindern.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
Referências
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