RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em
Summary
Descriviamo un metodo per identificare i regolatori sensibilizzati postembrionale di espressione proteica e la localizzazione in<em> C. elegans</em> Utilizzando un RNAi-based schermo genomica e un transgene integrato che esprime una funzionale, la proteina fluorescente tag.
Abstract
C. elegans ha dimostrato di essere un sistema modello utile per la scoperta e caratterizzazione funzionale di molti geni e vie del gene 1. Strumenti più sofisticati e le risorse per gli studi in questo sistema sono facilitare la scoperta continua di geni con fenotipi più sottili o ruoli.
Qui vi presentiamo un protocollo generalizzato abbiamo adattato per l'identificazione C. geni elegans con fenotipi postembrionale di interesse utilizzando RNAi 2. Questa procedura viene modificato facilmente per il fenotipo di dosaggio scelta, sia dalla luce ottiche o fluorescenza su un microscopio da dissezione o composto. Questo protocollo di screening sfrutta le risorse fisiche dell'organismo e gli strumenti molecolari del C. elegans comunità di ricerca ha prodotto. Come esempio, si dimostra l'utilizzo di un transgene integrato che esprime un prodotto fluorescente in una schermata RNAi per identificare i geni necessari per la localizzazione normale di questaprodotto in fase avanzata le larve e adulti. In primo luogo, abbiamo utilizzato un commercialmente disponibile libreria genomica RNAi con inserti di cDNA a lunghezza completa. Questa libreria facilita la rapida identificazione di candidati multiple riduzione RNAi del prodotto genico candidato. In secondo luogo, abbiamo generato un transgene integrato che esprime la nostra proteina fluorecently tag di interesse in un RNAi sensibile background. In terzo luogo, esponendo animali tratteggiati per RNAi, questo schermo consentire l'identificazione di prodotti genici che hanno un ruolo fondamentale embrionale che altrimenti mascherare un post-embrionale ruolo nel regolare la proteina di interesse. Infine, questo schermo utilizza un microscopio composto attrezzato per la risoluzione di singola cella.
Protocol
Discussion
Il metodo di screening RNAi qui presentata consente un'analisi sensibile e rapido di prodotti genici necessari per un normale (o transgenico) fenotipo postembrionale. L'esempio illustrato è uno schermo per i geni coinvolti nella localizzazione subcellulare di una proteina fluorescente etichettato. Tuttavia, questo protocollo può essere modificata per identificare geni che interessano altri fenotipi postembrionale di interesse.
Questo metodo si avvale di un approccio del gene candid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) per il dono della DBL-1 cDNA e il Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) per un marker di iniezione. Laboratorio del Dr. Barth Grant effettuato il bombardamento pistola gene per l'integrazione a basso numero di copie della GFP-tagged DBL-1 costrutto. Il laboratorio di René Garcia ha fornito assistenza tecnica durante la creazione del texIs100. Il René Garcia, Lint Robyn, e Hongmin Qin laboratori fornito consulenza produttivo. Questo lavoro è stato finanziato da fondi di start-up del Dipartimento TAMHSC di Medicina Molecolare e Cellulare. L'ambito composto e confocale disco rotante sono stati acquistati con fondi messi a disposizione dal dipartimento e il Collegio TAMHSC dell'Ufficio Medicina della Dean.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
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