Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em
Summary
Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem tarif<em> C. elegans</em> Bir RNAi tabanlı ekran genomik ve işlevsel, floresan etiketli protein ifade entegre bir transgen kullanarak.
Abstract
C. elegans çok sayıda gen ve gen yolları 1 keşfi ve fonksiyonel karakterizasyonu için değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Daha gelişmiş araçları ve bu sistemde çalışmaları için kaynakların daha ince fenotipleri veya rollere sahip genlerin sürekli keşif kolaylaştırır.
Burada biz C. tanımlamak için adapte genelleştirilmiş bir protokol sunmak RNAi 2 ile ilgi postembryonic fenotipleri ile elegans genleri. Bu işlem kolay olmadığını bir kesme veya bileşik mikroskop ışık veya floresan optik tarafından, tahlil tercih fenotipi değiştirilir. Bu tarama protokolü organizmanın fiziksel varlıkların ve moleküler araçlar C. istifade elegans araştırma topluluğu üretti. Bir örnek olarak, bu normal Lokalizasyon için gerekli olan genlerin tanımlanması için bir RNAi ekranda bir floresan ürünü ifade entegre bir transgen kullanımını göstermektedirgeç dönem larva ve yetişkinlerde ürün. İlk olarak, tam uzunluktaki cDNA uçları ile ticari olarak mevcut genomik RNAi kütüphanesi kullanılabilir. Bu kütüphane aday gen ürününün RNAi indirgenmesiyle birden aday hızlı bir şekilde tespit kolaylaştırmaktadır. İkincisi, biz bir RNAi duyarlı arka planda ilgi bizim fluorecently tagged proteini ifade eden bir entegre transgen oluşturulur. Üçüncüsü, RNAi için yumurtadan hayvanların teşhir ederek, bu ekran aksi ilgi protein düzenleyen bir post-embriyonik rolünü maskeleyeceği hayati bir role sahip embriyonik gen ürünlerinin belirlenmesi izin verir. Son olarak, bu ekran tek hücre çözümü için donanımlı bir bileşik mikroskop kullanır.
Protocol
Discussion
Burada sunulan RNAi tarama yöntemi, normal bir (ya da transgenik) postembryonic fenotipi için gerekli gen ürünlerinin hassas ve hızlı bir analizi sağlar. Gösterilen örnek bir floresan etiketli proteinin hücre içi lokalizasyonu ilgili genler için bir ekran. Ancak, bu protokolün diğer ilgi postembryonic fenotipleri etkileyen genleri tanımlamak için değiştirilebilir.
Bu yöntem, bir RNAi kütüphanesi kullanarak bir aday gen yaklaşımı yararlanır. Mutagenez tekniklerini kul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar bir enjeksiyon işaretleyici için dbl-1 cDNA ve Dr Christopher Rongo (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) ve hediye için Dr Rick Padgett (Waksman Enstitüsü, Rutgers Üniversitesi, NJ) teşekkür etmek istiyorum. Dr Barth Grant'ın laboratuvar gfp etiketli dbl-1 inşasının düşük kopya sayısı entegrasyonu için gen tabancası bombardımanı yapıldı. Rene Garcia laboratuar texIs100 oluşturulması sırasında teknik yardım sağladı. Rene Garcia, Robyn Lints ve Hongmin Qin laboratuarlar üretken tavsiye sağladı. Bu çalışma, Moleküler ve Hücresel Tıp TAMHSC Bölümü start-up fonları tarafından finanse edildi. Bileşik kapsamı ve iplik diske konfokal departmanı ve Dekan Tıp Ofisi TAMHSC Koleji tarafından sağlanan fonlar ile satın alındı.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
Referências
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genética. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genética. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genética. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
