Denne artikkelen viser innspillingen av individuelle celler fra fluorescensmerket merket neuronal populasjoner i intakt mus netthinnen. Ved å bruke to-foton infrarøde eksitasjon transgenetically merkede cellene var målrettet for patch-clamp opptak for å studere deres lys reaksjoner, mottagelig feltegenskaper, og morfologi.
Å studere fysiologiske egenskaper og synaptiske forbindelser av spesifikke nerveceller i intakt vev er en utfordring for de cellene som mangler iøynefallende morfologiske egenskaper eller vise en lav befolkningstetthet. Dette gjelder særlig retinal amacrine celler, en usedvanlig mangfoldig gruppe interneurons som utgjør omtrent 30 undertyper hos pattedyr 1. Selv være en avgjørende del av visuell prosessering ved å forme den retinal utgang 2, har de fleste av disse subtypene ikke blitt studert til nå i en funksjonell sammenheng, fordi møter disse cellene med et opptak elektrode er en sjelden hendelse.
Nylig er et mangfold av transgene mus linjer tilgjengelig som uttrykker fluorescerende markører som grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av arrangører for membran reseptorer eller enzymer som er spesifikke for bare en undergruppe av nevroner i et gitt vev 3,4. Disse pre-merkede cellene er derfor accessible til rettet microelectrode targeting henhold mikroskopiske kontroll, tillater systematisk studie av deres fysiologiske egenskaper in situ. Imidlertid er eksitasjon av fluorescerende markører ledsaget av risikoen for fototoksisitet for de levende vev. I netthinnen, er denne tilnærmingen tillegg hemmet av problemet som eksitasjon lys forårsaker passende stimulering av fotoreseptorene, og dermed påføre photopigment bleking og overføre retinal kretser inn en lett-tilpasset tilstand. Disse ulempene er løst ved å bruke infrarøde eksitasjon levert av en modus-låst laser i korte pulser av femtosecond rekkevidde. To-foton eksitasjon gir energi nok for fluoroforen eksitasjon og samtidig begrenser eksitasjon til en liten vev volum minimere farene ved photodamage 5. Dessuten etterlater det netthinnen mottakelig for visuelle stimuli siden infrarødt lys (> 850 nm) er bare dårlig absorbert av photopigments 6.
<p class = "jove_content"> I denne artikkelen vil vi demonstrere bruken av transgene mus retina å oppnå elektrofysiologiske in situ opptak fra GFP-uttrykke celler som er visuelt rettet av to-foton eksitasjon. Netthinnen er utarbeidet og vedlikeholdes i mørket og kan bli utsatt for optiske stimuli som projiseres gjennom kondensatoren av mikroskopet (Figur 1). Patch-clamp registrering av lys responser kan kombineres med fargestoff fylling å avsløre morfologi og for å se etter gap junction-mediert dye kopling til nabocellene slik at målcellen kan ved å studere på forskjellige eksperimentelle nivåer.Denne metoden gir mulighet til å studere elektriske egenskapene til spesifikke nevroner i intakt netthinnen i henhold til visuell veiledning uten å påvirke adaptational tilstanden på netthinnen. Det er spesielt egnet for karakterisering av celler som er i dag ganske dårlig studert på grunn av lav befolkningstetthet som de fleste bestandene av amacrine celler. To-foton eksitasjon tillater høy oppløsning og høy kontrast bildebehandling selv fra dypere deler av vevet 17, en forutsetning for nøyaktig målretting og vellykket patch-klemming av celler spesielt i INL med sin høye tetthet av celle organer.
Den isolerte musen netthinnen er levedyktig i 3-4 h under eksperimentelle forhold. Hvis den andre netthinnen er lagret i stummende mørke under kontinuerlig carbogen gassing, beholder den lilla fargen ubleket photopigment og kan brukes etter endt eksperimenter med den første netthinnen. I begynnelsen rettet motvalgt celle med mikropipette i retinal wholemount er litt utfordrende og krever litt øvelse, spesielt når du arbeider i mørket. Inkludert et fluorescerende fargestoff i mikropipette kan forenkle prosedyren, fordi celle og mikropipette er synlige under to-foton eksitasjon samtidig. Imidlertid kan legge til komponenter til den intracellulære løsningen vanskeliggjøre gigaseal formasjon eller føre til at opptakskvaliteten til å lide. Etter vellykket oppnådd, kan en god innspilling vare i ca 1 t.
Mens den infrarøde eksitasjon lyset i seg selv er bare dårlig absorbert av retinal fotoreseptorene, begeistret GFP-uttrykker cellene avgir lys i den synlige delen av spekteret. Imidlertid er fluorophores glade bare i en liten fokal volum som sannsynligvis ikke vil endre adaptational tilstanden på netthinnen. Alle de mer, eksitasjon er bare nødvendig for målretting og kan slås av under innspillingen av lys svar.
Den usefulness med denne tilnærmingen er allerede demonstrert av studier på bestemte populasjoner av amacrine celler 14,18 som elektrofysiologiske opptak ellers ville ha vært mulig bare ved et uhell 12. Endelig kan denne kraftige teknikken ytterligere utvides ved å inkludere en farmakologisk tilnærming 14, 2 Ca + bildebehandling 19 eller ved å bruke injiseres celler for immunocytochemical studier eller elektron mikroskopi. På den måten kan den funksjonelle plasseringen av en gitt celletype i retinal kretsene være unravelled.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 til KD og RW). Vi er takknemlige til Thomas Euler (Töbingen, Tyskland) for lys stimulering programvaren QDS.
Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |