Les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure
Summary
Ce manuscrit décrit trois protocoles complémentaires pour évaluer la toxicité de polyglutamine (polyQ)-extension protéines dans la levure<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Ces protocoles peuvent être facilement modifié pour contrôler la toxicité d'autres protéines mal repliées dans la levure.
Abstract
Mauvais repliement des protéines est associée à de nombreuses maladies humaines, en particulier les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington 1. La maladie de Huntington (HD) est provoquée par l'expansion de polyglutamine anormale d'un (polyQ) dans la région la protéine huntingtine. La protéine huntingtine polyQ-expansé atteint une conformation aberrante (c'est à dire qu'il misfolds) et entraîne une toxicité cellulaire 2. Au moins huit autres maladies neurodégénératives sont causées par des polyQ-extensions, y compris le spinocérébelleuse Ataxies et la maladie de Kennedy 3.
La levure organisme modèle a facilité des informations importantes sur la base cellulaire et moléculaire de la polyQ-toxicité, y compris l'impact des facteurs intra-et inter-moléculaire de polyQ-toxicité, et l'identification des mécanismes cellulaires qui sont déficients dans les cellules exprimant l'expansion polyQ- protéines 3-8. Importantment, de nombreux aspects de polyQ-toxicité qui ont été trouvés dans la levure ont été reproduites dans d'autres systèmes expérimentaux et dans une certaine mesure dans des échantillons provenant de patients HD, démontrant ainsi l'importance du modèle de la levure pour la découverte des mécanismes de base qui sous-tendent polyQ-toxicité.
Une manière directe et relativement simple de déterminer la toxicité polyQ-dans la levure est de mesurer les défauts de croissance de cellules de levure exprimant polyQ-expansion protéines. Ce manuscrit décrit trois approches expérimentales complémentaires pour déterminer la toxicité polyQ-dans la levure par la mesure de la croissance des cellules de levure exprimant polyQ-expansion protéines. Les deux premières approches expérimentales de surveiller la croissance des levures sur les assiettes, la troisième approche surveille la croissance des cultures de levures liquides en utilisant l'instrument BioscreenC.
En outre, ce manuscrit décrit les difficultés expérimentales qui peuvent survenir lors de la manipulation des modèles polyQ levure et décrit les stratégies qui vous aideront à éviter ou àminimiser ces difficultés. Les protocoles décrits ici peuvent être utilisées pour identifier et à caractériser les voies génétiques et des petites molécules qui modulent polyQ-toxicité. En outre, les tests décrits peuvent servir de modèles pour des analyses précises de la toxicité causée par d'autres maladies associées à des protéines mal repliées dans les modèles de levure.
Protocol
Discussion
Ce manuscrit présente trois approches expérimentales complémentaires pour mesurer la toxicité polyQ-dans la levure organisme modèle fondé sur une croissance réduite des cellules de levure exprimant toxiques polyQ-expansion protéines. Travail dans la levure a offert un aperçu de profondes dans les mécanismes de base cellulaires et moléculaires de repliement des protéines et de sa toxicité qui a suivi, y compris le mauvais repliement et la toxicité des polyQ-expansion protéines 9,11,12. Des expé…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail dans le laboratoire Duennwald est pris en charge par des subventions de la Fédération américaine pour recherche sur le vieillissement (AFAR), la Fondation des maladies héréditaires (HDF) et la Fondation William Wood.
Materials
| Name of instrument | Company | Catalogue number |
| Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
| BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
| 100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |
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