Mätning av γHV68 infektion hos möss
Summary
γ-herpesvirus (γ-HVS) etablera livslång persistens i sin värd. Infektion av möss med γ-HV68 ger ett genetiskt lätthanterlig<em> In vivo</em> Modell för karakterisering av livscykeln / patogenesen av γHVs. Detta protokoll beskriver detektering och kvantifiering av γHV68 infektion vid akut och latent ligger efter infektion av plaque-forming, infektionssjukdomar centrum och analyser qPCR.
Abstract
γ-herpesvirus (γ-HVS) är anmärkningsvärda för sin förmåga att skapa latenta infektioner av lymfoida celler 1. Den smala värdspektrum av mänskliga γ-HVS, såsom EBV och KSHV, har utgjort ett allvarligt hinder detaljerade patogena studier. Murina γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattande genetiska och biologiska likheter med mänskliga γ-HVS och är en naturlig patogen till murid gnagare 2. Som sådan, utvärdering av γHV68 infektion hos möss inavlade stammar i olika stadier av virusinfektion ger en viktig modell för att förstå virus livscykel och patogenes vid γ-HVS infektion.
Efter nasal ympning, som γHV68 infektion resulterar i akut viremi i lungan är senare lösas in i en latent infektion av splenocytes och andra celler, som kan aktiveras under hela värden 3,4. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur du använder plack analysen att bedömas infektiöst virus titer i lungan homogenat på Vero cell monolager i ett tidigt skede (5 – 7 dagar) av post-intranasalt infektion (dpi). Medan akut infektion är i stort sett rensat 2 – 3 veckor postinfection, en latent infektion av γHV68 är etablerad runt 14 dpi och underhållas senare i mjälten på möss. Latent infektion drabbar oftast en mycket liten population av celler i infekterade vävnader, där viruset stannar vilande och stänger de flesta av dess genuttryck. Latent infekterade splenocytes reaktivera spontant viruset vid explantation i vävnadsodling, som kan rekapituleras av en smittsam centrum (IC) analys för att bestämma virus latent belastning. För att ytterligare uppskatta mängden virala genomet exemplar i akut och / eller latent infekterade vävnader, kvantitativ realtids-PCR (qPCR) används för maximal känslighet och precision. Den kombinerade analyser av resultaten av qPCR och plack analys och / eller IC-analysen kommer att avslöja Spatiotemporal profiler av viralareplikering och smittsamhet in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 har i stor utsträckning använts som en modell för att förstå uppkomsten av mänskliga γ-HVS 2,4,5. I detta protokoll beskrivs vi tre rutinmässigt används metoder, inklusive plack analys för smittsamma virus titer, IC-analys för virus latent belastning och qPCR för virusgenom last, för att utvärdera akut och latent infektion av γHV68 efter intranasal inokulationen hos möss.
På skylten analys har använts i stor utsträckning att bestämma viruset titer i infe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för de tekniska råd och stöd från Ren Sun (University of California, Los Angeles) och Seungmin Hwang (Washington University). Detta arbete har finansierats av Baxter Foundation, National Institutes of Health bidrag (R01 CA140964 och R21 AI083841 till C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
