يوصف أسلوب لتحديد النشاط كيناز خلات. هذا الاختبار يستخدم لتحديد رد الفعل المباشر لنشاط إنزيم وحركية كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات مع يقبلون فسفوريل مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمعايرة الفوسفات الاسيتيل أخرى أو أسيتيل التميم استخدام الانزيمات.
كيناز خلات ، عضوا في لخلات والسكر كيناز – Hsp70 – الأكتين فوق الفصيلة انزيم (ASKHA) 1-5 ، هو المسؤول عن الفسفرة عكسها من خلات لاستغلال الفوسفات ATP الاسيتيل باعتبارها الركيزة. كاينيسات خلات موجودة في كل مكان في البكتيريا وجدت في أحد من جنس الأركيا ، وموجودة أيضا في الميكروبات من حقيقيات النوى 6. وتتميز معظم كيناز خلات جيدا هو أن من thermophila المنتجة للغاز الميثان Methanosarcina archaeon 7-14. وقد تم عزل وكيناز خلات التي تستطيع الاستفادة منها فقط PP ط ولكن ليس للاعبي التنس المحترفين في اتجاه تشكيل الاسيتيل الفوسفات من نسج المتحولة ، والعامل المسبب للمرض الزحار الأميبي ، وحتى الآن فقط تم العثور على 15،16 في هذا جنس.
في اتجاه تشكيل الفوسفات الاسيتيل ، ويقاس عادة خلات النشاط كيناز باستخدام مقايسة hydroxamate ، وصف لأول مرة من قبل Lipmann17-20 ، ومقايسة يقترن التي يقترن تحويل ATP إلى ADP للأكسدة NADH إلى NAD + من كيناز البيروفات الانزيمات واللاكتات نازعة 21،22 ، أو فحص قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوية بعد رد فعل للمنتج الفوسفات الاسيتيل مع هيدروكسيل 23. النشاط في المقابل ، يقاس خلات تشكيل الاتجاه اقتران تشكيل ATP من ADP في الحد من NADP + إلى NADPH من هيكسوكيناز الانزيمات والجلوكوز 6 فوسفات نازعة 24.
نحن هنا وصف طريقة للكشف عن النشاط كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات التي لا تتطلب اقتران الانزيمات ، ولكن بدلا من ذلك على ويستند تقرير المباشر للاستهلاك الفوسفات الاسيتيل. بعد رد الفعل الأنزيمية ، يتم تحويل الفوسفات الاسيتيل المتبقية لمجمع الحديد hydroxamate التي يمكن قياسها spectrophotometrically ، أما بالنسبة للمقايسة hydroxamate. وهكذا ، خلافا للشارعandard مقايسة بالإضافة لهذا الاتجاه الذي يعتمد على إنتاج ATP من ADP ، ويمكن استخدام هذا الاختبار المباشر لتحركات خلات التي تنتج ATP أو PP ط.
الكشف عن الفوسفات الاسيتيل في هذا الاختبار يعتمد على تركيز كاف من هيدروكلوريد هيدروكسيل والتركيز والحموضة من محلول كلوريد الحديديك. وتغيير حجم مقايسة تتطلب إعادة النظر في كل من هذه المكونات. ردود الفعل الأنزيمية الموصوفة هنا أجريت في 37 درجة مئوية مع انتهاء تنفيذ هي?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل الجائزة NSF # 0920274 وجنوب كارولينا تجربة مشروع محطة (SC – 1700340) لKSS. هذه الورقة التقنية رقم 5929 من المساهمة في تجربة جامعة كليمسون محطة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |