Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase
Summary
Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.
Abstract
Acetaat kinase, een lid van de acetaat en suiker kinase-Hsp70-actine (ASKHA) enzym superfamilie 1-5, is verantwoordelijk voor de reversibele fosforylering van acetaat tot acetyl fosfaat gebruik te maken van ATP als een substraat. Acetaat kinases zijn alomtegenwoordig in de bacteriën, gevonden in een genus van de Archaea, en zijn ook aanwezig in microben van de Eukarya 6. De meest gekarakteriseerd acetaat kinase is dat vanaf het methaan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Een acetaat kinase die alleen gebruik kunnen maken van PP-i, maar niet ATP in de acetyl fosfaat-vormende richting is geïsoleerd van Entamoeba histolytica, de verwekker van amoeben dysenterie, en heeft tot nu toe alleen gevonden in dit genus 15,16.
In de richting van acetyl fosfaat formatie, is acetaat kinase-activiteit meestal gemeten met behulp van de hydroxamaat test, het eerst beschreven door Lipmann17-20, een gekoppelde test waarin de omzetting van ATP naar ADP is gekoppeld aan oxidatie van NADH tot NAD + door de enzymen pyruvaatkinase en lactaat dehydrogenase 21,22, of een test meet release van anorganisch fosfaat na reactie van de acetyl-fosfaat product met hydroxylamine 23. Activiteit in het tegenovergestelde, is acetaat-vormende richting gemeten door de koppeling van ATP vorming van ADP tot de reductie van NADP + om NADPH door de enzymen hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase 24.
Hier beschrijven we een methode voor de detectie van acetaat kinase-activiteit in de richting van acetaat formatie die niet nodig koppeling enzymen, maar in plaats daarvan is gebaseerd op directe bepaling van de acetyl fosfaat consumptie. Na de enzymatische reactie neemt het resterende acetyl fosfaat omgezet in een ijzer hydroxamaat complex, dat spectrofotometrisch kan worden, gemeten als voor de hydroxamaat test. Dus, in tegenstelling tot de standard gekoppeld test voor deze richting, dat is afhankelijk van de productie van ATP uit ADP, kan dit direct assay worden gebruikt voor acetaat kinases die ATP of PP i te produceren.
Protocol
Discussion
De detectie van acetyl fosfaat in deze test is afhankelijk van een voldoende concentratie van hydroxylamine hydrochloride en de concentratie en zuurgraad van de ijzerchloride-oplossing. Wijziging van de test volume vereist heroverweging van beide componenten. De enzymatische reacties die hier beschreven werden uitgevoerd bij 37 ° C met de hydroxylamine beëindiging uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 5 minuten. Deze hogere temperatuur is van cruciaal belang om voor een snelle conversie van de resterende acetyl fosfaat naa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSF award # 0920274 en South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) aan KSS. Dit papier is technische bijdrage No 5929 van de Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
Referências
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Bioquímica. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
