זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים
Summary
שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.
Abstract
קינאז Acetate, חבר אצטט ו-kinase Hsp70-אקטין סוכר (ASKHA) אנזים superfamily 1-5, אחראי זירחון הפיך של אצטט כדי פוספט אצטיל ניצול ATP כמו המצע. קינאזות Acetate חיידקים נמצאים בכל מקום, נמצא סוג אחד של קדומים, והם נוכחים גם חיידקים של Eukarya 6. קינאז אצטט ביותר מאופיין גם הוא מן מתאן לייצור archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. קינאז אצטט אשר יכול לנצל רק PP i-ATP, אך לא בכיוון אצטיל פוספט יוצרי כבר מבודד Entamoeba histolytica, הסוכן סיבתי של דיזנטריה אמבית, ויש לו עד כה נמצאו רק 15,16 הסוג הזה.
בכיוון של היווצרות אצטיל פוספט, פעילות קינאז אצטט נמדדת בדרך כלל באמצעות assay hydroxamate, שתוארה לראשונה על ידי ליפמן17-20, assay מצמידים שבו ההמרה של ה-ATP ל ADP היא מצמידים את החמצון של NADH ל NAD + ע"י קינאז האנזימים pyruvate ו לקטט דהידרוגנז 21,22, או מדידה assay שחרורו של פוספטים אנאורגניים אחרי התגובה של המוצר פוספט אצטיל עם hydroxylamine 23. פעילות ההיפך, אצטט יוצרי כיוון נמדד על ידי צימוד היווצרות ATP מ – ADP לצמצום NADP + ל NADPH ידי hexokinase האנזימים וגלוקוז 6 פוספט דהידרוגנז 24.
כאן אנו מתארים שיטה לגילוי של פעילות קינאז אצטט לכיוון היווצרות אצטט שאינו דורש צימוד אנזימים, אך הוא מבוסס על נחישות במקום ישירה של צריכת פוספט אצטיל. לאחר התגובה האנזימטית, פוספט אצטיל הנותרים מומר קומפלקס hydroxamate וברזל כי ניתן למדוד spectrophotometrically, כמו assay hydroxamate. לכן, בניגוד רחובassay מצמידים אנדאר עבור בכיוון הזה תלויה ייצור ATP מ – ADP, assay הזה ישיר יכול לשמש קינאזות אצטט המייצרים ATP או PP אני.
Protocol
Discussion
הגילוי של פוספט אצטיל ב assay זה תלוי בריכוז מספיק hydrochloride hydroxylamine ואת ריכוז החומציות של התמיסה כלורי וברזל. שינוי של נפח assay ידרוש בדיקה מחודשת של שני רכיבים אלה. תגובות אנזימטיות המתואר כאן בוצעו על 37 מעלות צלזיוס עם סיום hydroxylamine שבוצעה ב 60 ° C במשך 5 דקות. זו טמפרטורה גבו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הפרס NSF # 0920274 ודרום קרוליינה תחנת ניסוי פרויקט (SC-1700340) כדי KSS. נייר זה לא תרומה טכני 5929 של תחנת הניסיונות אוניברסיטת קלמסון.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
Referências
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Bioquímica. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
