Direkte Påvisning av acetat-forming aktivitet av enzymet Acetat Kinase

Summary

En metode for bestemmelse av acetat kinase aktivitet er beskrevet. Denne analysen benytter en direkte reaksjon for å bestemme enzymaktivitet og kinetikk av acetat kinase i acetat-forming retning med forskjellige phosphoryl akseptorer. Videre kan denne metoden benyttes for analysere andre acetyl fosfat eller acetyl-CoA utnytte enzymer.

Abstract

Acetat kinase, et medlem av acetat og sukker kinase-Hsp70-aktin (ASKHA) enzym superfamily ^1-5, er ansvarlig for reversibel fosforylering av acetate til acetyl fosfat utnytte ATP som substrat. Acetat kinaser er allestedsnærværende i Bakterier, som finnes i en slekt av Archaea, og er også til stede i mikrober av Eukarya ^6. Den mest godt karakterisert acetate kinase er at fra metan-produserende archaeon Methanosarcina thermophila ^7-14. En acetate kinase som bare kan benytte PP _jeg, men ikke ATP i acetyl fosfat-forming retning har vært isolert fra Entamoeba histolytica, den forårsaker agent for amøbedysenteri, og har så langt bare blitt funnet i denne slekten ^15,16.

I retning av acetyl fosfat formasjonen, er acetate kinase aktivitet vanligvis målt ved hjelp av hydroxamate analysen, først beskrevet av Lipmann^17-20, en kombinert analyse hvor konvertering av ATP til ADP er koblet til oksidasjon av NADH til NAD ⁺ av enzymene pyruvat kinase og laktat dehydrogenase ^21,22, eller en analyse som måler utslipp av uorganisk fosfat etter reaksjonen til acetyl fosfat produktet med hydroksylamin ^23. Aktiviteten i det motsatte, er acetate-forming retning målt ved kopling ATP dannelse fra ADP til reduksjon av NADP ⁺ til NADPH av enzymer hexokinase og glukose 6-fosfat dehydrogenase ^24.

Her beskriver vi en metode for påvisning av acetat kinase aktivitet i retning av acetat formasjon som ikke krever kopling enzymer, men er i stedet basert på direkte fastsettelse av acetyl fosfat forbruk. Etter enzymatisk reaksjon, er gjenværende acetyl fosfat omdannes til en Ferric hydroxamate kompleks som kan måles spektrofotometrisk, som for hydroxamate analysen. Derfor, i motsetning til standard kombinert analysen for denne retningen er avhengig av produksjon av ATP fra ADP, kan dette direkte analysen brukes for acetate kinaser som produserer ATP eller PP _jeg.

Protocol

Den generelle ordningen med denne protokollen er skissert i figur 1. 1. Løsning Forberedelse for Standard Kurver og Assays Forbered 100 mL av en 2 mol / L løsning av hydroksylamin-HCl. Vei opp 13,9 g hydroksylamin hydroklorid (MW 69,49 g / mol) og oppløses i ca 50 mL destillert-avionisert vann (DDH 2 O). Juster pH til 7,0 med kaliumhydroksid pellets eller en konsentrert løsning. Ta det endelige volumet til 100 ml. Løsningen kan oppbevares i romtemperatur i opptil 3…

Discussion

Påvisning av acetyl fosfat i denne analysen er avhengig av en tilstrekkelig konsentrasjon av hydroksylamin hydroklorid og konsentrasjon og surhet av Ferric klorid løsningen. Endring av analysen volum vil kreve ny vurdering av begge disse komponentene. Den enzymatiske reaksjoner som beskrives her ble utført ved 37 ° C med hydroksylamin oppsigelse utført ved 60 ° C i 5 minutter. Dette høyere temperatur er avgjørende for å tillate rask konvertering av de resterende acetyl fosfat til acetyl hydroxamate. Tidspunktet…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetyl phosphate	Sigma Aldrich	01409	Lithium Salt (97% )
Sodium phosphate monobasic (dehydrate)	ThermoFisher	S381
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	ThermoFisher	S374
Magnesium chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Ferric chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	I88
Trichloroacetic acid	ThermoFisher	A324
Hydroxylamine hydrochloride	ThermoFisher	H330
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt	Sigma Aldrich	A2754
Biomate III Spectrophotometer	ThermoFisher	142982082	Standard UV/Vis spectrophotometer