Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Summary

Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.

Abstract

Quinase acetato, um membro do acetato e-quinase Hsp70-actina açúcar superfamília de enzimas (ASKHA) ^1-5, é responsável pela fosforilação reversível de acetato de acetil fosfato ATP, utilizando como substrato. Acetato de quinases são onipresentes na bactéria, encontrada em um gênero de Archaea, e também estão presentes em micróbios da Eukarya ^6. O acetato quinase mais bem caracterizado é que a partir do metano produzindo archaeon Methanosarcina thermophila ^14/07. Uma quinase de acetato, que só pode utilizar PP _i ATP, mas não na direção do acetil-fosfato formando foi isolado de Entamoeba histolytica, o agente causador da disenteria amebiana, e até agora só foi encontrado nesta ^15,16 gênero.

Na direção da formação de fosfato de acetil, acetato de atividade da quinase é normalmente medido utilizando o ensaio de hidroxamato, primeiramente descrita por Lipmann^17-20, um ensaio acoplado em que a conversão de ATP a ADP é acoplada a oxidação de NADH para NAD ⁺ pela enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase ^21,22, ou um ensaio de medição de liberação de fosfato inorgânico após a reação do produto acetil fosfato com hidroxilamina ^23. Atividade no lado oposto, o acetato de formação de sentido é medida pelo acoplamento formação de ATP a partir de ADP para a redução do NADP ⁺ a NADPH pela hexoquinase enzimas e glicose 6-fosfato desidrogenase ^24.

Aqui nós descrevemos um método para a detecção de atividade de acetato quinase na direção da formação de acetato de que não necessita de enzimas de acoplamento, mas em vez disso é baseada na determinação direta do consumo de fosfato de acetila. Após a reação enzimática, permanecendo acetil fosfato é convertido em um complexo hidroxamato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente, como para o ensaio hidroxamato. Assim, ao contrário do stensaio acoplado andard para esta direcção, que é dependente da produção de ATP a partir de ADP, este ensaio direto podem ser utilizados para quinases acetato que produzem ATP ou PP _i.

Protocol

O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1. 1. Preparação solução para Curvas padrão e Ensaios Prepare 100 mL de solução 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de cloridrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL de água destilada deionizada-(DDH 2 O). Ajustar o pH para 7,0 utilizando pellets de hidróxido de potássio ou uma solução concentrada. Reduzir o volume final de 100 mL. A solução pode ser armazen…

Discussion

A detecção de fosfato de acetil neste ensaio é dependente de uma concentração suficiente de cloridrato de hidroxilamina, e da concentração e da acidez da solução de cloreto férrico. Alteração do volume de ensaio requer a reconsideração de ambos os componentes. As reações enzimáticas descritas aqui foram realizados a 37 ° C com o término hidroxilamina realizada a 60 ° C por 5 minutos. Esta temperatura mais elevada é fundamental para permitir a rápida conversão do fosfato restantes acetil para hidro…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetyl phosphate	Sigma Aldrich	01409	Lithium Salt (97% )
Sodium phosphate monobasic (dehydrate)	ThermoFisher	S381
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	ThermoFisher	S374
Magnesium chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Ferric chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	I88
Trichloroacetic acid	ThermoFisher	A324
Hydroxylamine hydrochloride	ThermoFisher	H330
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt	Sigma Aldrich	A2754
Biomate III Spectrophotometer	ThermoFisher	142982082	Standard UV/Vis spectrophotometer