Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama
Summary
Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.
Abstract
Asetat kinaz, asetat ve şeker kinaz-HSP70-aktin (ASKHA) enzim süperailesinin 1-5 bir üyesi, bir substrat olarak ATP kullanan asetil fosfat asetat geri dönüşümlü fosforilasyon için sorumludur. Asetat kinazlar Archaea bir cins bulundu, Bakteriler her yerde, ve aynı zamanda ökaryotlarının 6 mikroplar bulunmaktadır. En iyi karakterize asetat kinaz olduğunu metan üreten archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Sadece asetil fosfat oluşturan yönde ATP i PP yararlanmak ancak bir asetat kinaz Entamoeba histolytica, amip dizanteri etkeni izole edilmiş ve şimdiye kadar sadece bu cinsin 15,16 olmuştur.
Asetil fosfat oluşum doğrultusunda, asetat kinaz aktivitesini genellikle ilk Lipmann tarafından açıklanan, hydroxamate tahlil kullanarak ölçülür.17-20, enzimler piruvat kinaz ve laktat dehidrogenaz 21,22 ADP ATP dönüşüm NAD NADH oksidasyonu birleştiğinde olduğu bir birleştiğinde tahlil + veya asetil fosfat ürün reaksiyon sonra inorganik fosfatın serbest ölçen bir test hidroksilamin 23. Etkinlik tam tersi, asetat oluşturan yönü ADP NADP azaltılması + enzimler heksokinaz ve glukoz 6-fosfat dehidrogenaz 24 NADPH, ATP oluşumu birleştirilmesi ile ölçülür .
Burada kaplin enzimler gerektirmez asetat oluşumu yönünde asetat kinaz aktivitesinin tespiti için bir yöntem tarif, ama onun yerine asetil fosfat tüketimi doğrudan belirlenmesi üzerine dayanır. Enzimatik reaksiyon sonra, kalan asetil fosfat hydroxamate tayini için spektrofotometrik olarak ölçülmüş olabilir ferrik hydroxamate karmaşık dönüştürülür. Böylece, I. aksineADP ATP üretimine bağımlı bu yönde andard birleştiğinde tahlil, doğrudan bu testi ATP veya PP i üretmek asetat kinazlar için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Bu testte asetil fosfat algılama hidroksilamin hidroklorür yeterli konsantrasyon ve ferrik klorür çözeltisi konsantrasyonu ve asit bağlıdır. Bu bileşenlerin her iki testin hacmi değişiklik yeniden gözden geçirilmesini gerektirebilir. Enzimatik reaksiyonları burada açıklanan 37 ° yapıldı ° C, 5 dakika 60 ° C hidroksilamin sonlandırma. Bu yüksek sıcaklık asetil hydroxamate kalan asetil fosfat hızlı dönüşüm için izin verecek kritik öneme sahiptir. Absorbans renk geliştirme adım ve ölçü…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NSF ödül # 0920274 ve Güney Carolina Deney İstasyonu Projesi (SC-1.700.340) KSS tarafından desteklenen oldu. Bu makale, Clemson Üniversitesi Experiment Station 5929 Teknik Katkı No.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | ThermoFisher | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic acid | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
Referências
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Bioquímica. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
