Direkte påvisning af acetat-dannende aktivitet af enzymet Acetat Kinase

Summary

En metode til bestemmelse af acetat kinase aktivitet er beskrevet. Denne analyse anvender en direkte reaktion til bestemmelse af enzymaktivitet og kinetik af acetat kinase i acetat-dannende retning med forskellige phosphoryl receptorer. Desuden kan metoden anvendes til analysering andre acetyl fosfat eller acetyl-CoA udnytte enzymer.

Abstract

Acetat kinase, et medlem af acetat og sukker kinase-HSP70-actin (ASKHA) enzym superfamily ^1-5, er ansvarlig for reversibel phosphorylering af acetat til acetyl fosfat udnytte ATP som substrat. Acetat kinaser er allestedsnærværende i de bakterier, der findes i en slægt af Archaea, og er også til stede i mikrober af Eukarya ^6. Den mest velkarakteriserede acetat kinase er, at fra den metan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila ^7-14. En acetat kinase, der kun kan udnytte PP _I, men ikke ATP i acetyl fosfat-dannende retning har været isoleret fra Entamoeba histolytica, det agens af dysenteri, og har hidtil kun fundet i denne slægt ^15,16.

I retning af acetyl fosfat dannelse, er acetat kinase aktivitet typisk måles efter den hydroxamate assay, første gang beskrevet af Lipmann^17-20, en koblet assay, hvor omdannelsen af ATP til ADP, er koblet til oxidation af NADH til NAD ⁺ ved de enzymer pyruvat kinase og laktat dehydrogenase ^21,22, eller en assay måler frigivelse af uorganisk fosfat efter reaktion af acetyl fosfat produktet med hydroxylamin ^23. Aktiviteten i det modsatte, er acetat-dannende retning, målt ved at koble ATP dannelsen fra ADP til en reduktion af NADP ⁺ til NADPH af enzymer hexokinase og glucose 6-phosphat ^{dehydrogenase-24.}

Her beskriver vi en metode til påvisning af acetat kinase aktivitet i retning af acetat formation, der ikke kræver kobling enzymer, men er i stedet baseret på direkte bestemmelse af acetyl fosfat forbrug. Efter den enzymatiske reaktion, der er tilbage acetyl fosfat omdannes til en ferri hydroxamate kompleks, der kan måles spektrofotometrisk, som for hydroxamate analysen. Således, i modsætning til standard koblet assay for denne retning, er afhængig af produktionen af ATP fra ADP, kan denne direkte analyse skal bruges til acetat kinaser, der producerer ATP eller PP _i.

Protocol

Den overordnede opbygning af denne protokol er skitseret i figur 1. 1. Løsning Forberedelse til Standard Kurver og Analyser Forbered 100 ml af en 2 mol / L opløsning af hydroxylamin-HCl. Der afvejes 13,9 g hydroxylamin hydrochlorid (MW 69,49 g / mol) og opløses i 50 ml destilleret, demineraliseret vand (Hedeselskabet 2 O). Justér pH til 7,0 ved hjælp af kaliumhydroxid piller eller en koncentreret opløsning. Bring den endelige volumen til 100 ml. Løsningen kan opb…

Discussion

Påvisning af acetyl fosfat i denne test er afhængig af en tilstrækkelig koncentration af hydroxylamin hydrochlorid og koncentrationen og surhedsgrad ferrichloridopløsning. Ændring af analysen volumen vil kræve en revurdering af begge disse komponenter. Den enzymatiske reaktioner beskrevet her blev udført ved 37 ° C med hydroxylamin opsigelse udføres ved 60 ° C i 5 minutter. Denne højere temperatur er afgørende for at muliggøre en hurtig konvertering af de resterende acetyl fosfat til acetyl hydroxamate. Tim…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetyl phosphate	Sigma Aldrich	01409	Lithium Salt (97% )
Sodium phosphate monobasic (dehydrate)	ThermoFisher	S381
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	ThermoFisher	S374
Magnesium chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Ferric chloride (hexahydrate)	ThermoFisher	I88
Trichloroacetic acid	ThermoFisher	A324
Hydroxylamine hydrochloride	ThermoFisher	H330
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt	Sigma Aldrich	A2754
Biomate III Spectrophotometer	ThermoFisher	142982082	Standard UV/Vis spectrophotometer