キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚
Summary
これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。<em>ショウジョウバエ</em>単一分子生物物理学の研究のための胚。我々は、胚を収集する胚溶解液を作成し、その微小管（MTS）を重合する方法を示しています。キネシンは、MTSでそれを固定するキネシン-MT複合体をスピンダウンし、ATPの添加によってMTSからキネシンを解放することによって精製される。
Abstract
モータータンパク質は微小管に沿って貨物を移動し、特定のサブ携帯の場所にそれらを運ぶ。変更されたトランスポートが微小管に基づいてモータの輸送とその調節を理解し、神経変性疾患の様々な根底にあることが示唆されているため、おそらく最終的に改良された治療法につながる。キネシン-1はATPの加水分解により微小管の電源（MTS）に沿って順行性（プラス端）方向に移動する真核生物のモータータンパク質である。ここでは、このように、単一分子生物物理学の研究とショウジョウバエの遺伝学の組み合わせを可能にする、 ショウジョウバエの胚からアクティブな完全な長さのキネシンを分離するための詳細な精製プロトコールを報告します。カップ当たり約1000人の女性で、約50敷設カップを皮切りに、我々は一晩のコレクションを行った。これは、パックされた胚の約10ミリリットルを提供した。胚（胚の約9グラムが得られる）dechorionated漂白剤であったし、ホモジナイズした。 AFTERの中断は、ホモジネートを高速遠心分離に続いて低速のスピンを用いて明らかにした。明らかに上清は、MTSを重合させるGTPおよびタキソールで処理した。キネシンは、ATPアナログ、室温で5'-アデニル酸imidodiphosphateを追加することにより、重合MTの上に固定化されました。キネシンの結合した後、微小管は、ショ糖クッションを介して高速遠心分離を介して沈殿させた。微小ペレットを再懸濁し、このプロセスが繰り返されました。最後に、ATPはMTSからキネシンを解放するために追加されました。高速遠心分離し上清中にキネシンを残して、MTをスピンダウン。このキネシンは、さらに精製するためにフィルタ100 KDカットオフを使用して遠心濾過し、分注し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存されているにスナップブロッティングSDSゲル電気泳動とウェスタン精製サンプルを用いて行った。最後の遠心濾過工程の前と後精製したサンプルの運動in vitroで単一分子の微小管のアッセイで用いて評価した。遠心濾過前と後のキネシン分画は、以前に文献で報告されているように（processivity）を示した。さらに実験では、キネシンやその他の輸送関連タンパク質間の相互作用を評価するために進行中です。
Protocol
Discussion
マウス脳は同様に12使用されているものの、ウシの脳は、フルレングスキネシンを精製するために最も広く使用されている出発材料11である。キネシン源としてウシの脳を使用しての大規模な欠点は、新鮮な原料の可用性です。屠殺場は、通常アクセスできないと、脳はアクティブキネシンを得るために非常に新鮮でなければなりません。さらに、若い牛の脳だけが有効であ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトの支援と支援のためのクリス·ガイ、ジェイソン·デル·リオに感謝します。この作品は、RO1 SPGへの助成金GM070676によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
Referências
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