Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아
Summary
이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는 프로토콜입니다<em> Drosophila</em> 단일 분자 biophysical 연구를위한 배아. 우리는 배아를 수집 배아 lysate를 확인한 다음 microtubules (MTS)를 중합하는 방법을 보여줍니다. Kinesin는 MTS에 immobilizing Kinesin-MT 컴플렉스를 회전 후 ATP 첨가를 통해 MTS에서 kinesin를 공개함으로써 정화된다.
Abstract
모터 단백질은 microtubules 따라 cargos를 이동하고, 구체적인 하위 세포 위치로 그들을 수송. 변경된 전송이 미세 소관 기반 모터 수송 및 그 규정을 이해하고, neurodegenerative 질병의 다양한 기초하도록 권장되기 때문에 가능성이 궁극적으로 향상된 치료 접근법으로 이어질 것입니다. Kinesin-1은 ATP의 가수 분해에 의해 구동 microtubules (MTS)를 따라 anterograde (플러스 엔드) 방향으로 이동 진핵세포 모터 단백질이다. 여기에서 우리는 따라서 단일 분자 biophysical 연구와 Drosophila 유전자의 조합을 허용, Drosophila의 배아에서 활성 전체 길이 kinesin를 분리하기위한 세부적인 정화 프로토콜을보고합니다. 잔 당 약 1000 여성과 함께 약 50 누워있는 컵 것부터 시작해서, 우리는 밤새 컬렉션을 수행. 이것은 포장 배아들 중 약 10 ML을 제공했습니다. 배아는 (배아의 약 9g을하였으며) dechorionated 표백했다, 그리고 균질. AFter 장애는 homogenate는 고속 원심 분리에 의해 다음 저속 회전을 사용하여 명확히했다. 명확히 뜨는는 MTS를 중합하기 위해 GTP와 taxol로 치료되었다. Kinesin는 ATP 아날로그, 상온에서 5'-adenylyl imidodiphosphate을 추가하여 polymerized MTS에 고정화되었다. kinesin 구속력 후 microtubules은 자당 쿠션을 통해 고속 원심 분리를 통해 sedimented되었다. 미세 소관 펠렛 그런 다음 다시 중지되고,이 과정이 반복되었다. 마지막으로 ATP는 MTS에서 kinesin을 출시하도록 추가되었습니다. 고속 원심 분리 후 뜨는에서 kinesin두고, MTS를 불러 냈어요. 이 kinesin이 더 정화를 위해 필터 100 KD 인하를 이용하여 원심 여과를 받게되었다 aliquoted, 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 모래 바닥 SDS 겔 전기 영동과 서양은 정화 샘플을 사용하여 수행되었다. 최종 원심 여과 단계 전후 정화 샘플 모터 활동체외 단일 분자 미세 소관 분석에 사용하여 평가되었다. 이전 문헌에 보고된대로 원심 여과 전후 kinesin의 분수는 processivity을 보여주었다. 또한 실험 kinesin 및 기타 운송 관련 단백질 간의 상호 작용을 평가할 진행되고 있습니다.
Protocol
Discussion
murine 두뇌는 물론 12 사용되고 있지만 소의 머리, 전신 kinesin을 정화하기 위해 가장 널리 사용되는 출발 물질 11. kinesin 원본으로 소 두뇌를 사용하는 큰 단점은 신선한 시작하는 자료를 사용할 수있다 : slaughterhouses은 일반적으로 액세스할 수 있으며, 두뇌 활성 kinesin를 얻기 위해 매우 신선해야합니다. 또한, 젊은 암소만을 두뇌가 효과적입니다. 마지막으로, 암소의 유전자 조작은 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
크리스 Ngai이 프로젝트들의 지원과 도움 제이슨 델 리오에 대한 특별 감사합니다. 이 작품은 RO1 SPG에 부여 GM070676에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
Referências
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