Vi har udviklet nye laboratorie-værktøjer og protokoller for intravital billeddannelse erhvervelse af brissel. Vores teknik skal hjælpe med identifikationen af "nicher" i thymus, hvor T-celle udvikling sker.
To-foton mikroskopi (TPM) giver billedet opkøb i dybe områder inde i væv og organer. I kombination med udviklingen af nye stereotaktisk værktøjer og kirurgiske procedurer, bliver TPM en kraftfuld teknik til at identificere "nicher" inde organer og til at dokumentere cellulære "adfærd" i levende dyr. Mens intravital billedbehandling giver oplysninger, der bedst ligner den virkelige cellulære adfærd inde i orglet, er det både mere omstændelig og teknisk krævende med hensyn til nødvendigt udstyr / procedurer end alternative ex vivo imaging erhvervelse. Således beskriver vi en kirurgisk procedure, og romanen "stereotaktisk" orgel holder, der gør det muligt for os at følge bevægelserne af Foxp3 +-celler i thymus.
Foxp3 er master regulator til generering af regulatoriske T-celler (Tregs). Desuden kan disse celler skal klassificeres efter deres oprindelse: dvs. brissel-opdelte Tregs kaldes "naturligt forekommende Tregs" (nTregs), som opposed til perifert-konverterede Tregs (pTregs). Selvom betydelig mængde forskning har været rapporteret i litteraturen om fænotype og fysiologi af disse T-celler, meget lidt er kendt om deres in vivo interaktioner med andre celler. Denne mangel kan skyldes mangel af teknikker, der ville tillade sådanne observationer. Protokollen er beskrevet i dette dokument indeholder et middel mod denne situation.
Vores protokol består i at bruge nøgne mus, der mangler et endogent thymus, da de har en punktlig mutation i DNA-sekvensen, at kompromiser differentieringen af nogle epitelceller, herunder thymus epitelceller. Nude mus blev gamma-bestrålet og rekonstitueres med knogle græskar (BM) fra Foxp3-KI GFP / GFP mus. Efter BM opsving (6 uger) modtog hvert dyr embryonale brissel transplantation inde i nyrerne kapsel. Efter thymus accept (6 uger) blev dyrene bedøvede, nyrene, der indeholdertransplanteret thymus blev afsløret, fast i vores orgel holderen, og holdes under fysiologiske betingelser for in vivo imaging af TPM. Vi har brugt denne fremgangsmåde for at undersøge indflydelse af narkotika i den generation af regulatoriske T-celler.
I dette papir har vi demonstreret procedurerne for to-foton scanning af thymocytter inde i et levende dyr. Vi har også beskrevet nogle parametre, man skal nøje kontrol, såsom en fortsættelse af blodgennemstrømningen og vedligeholdelse af orglet temperatur under de billeddiagnostiske procedurer. Ikke desto mindre, på trods af omhyggelig indsats at holde orglet stabil, kan bevægelsesfejl som "orgel glide" forekomme. Posterior billedet korrektion kan udføres ved udvikling af algoritmer specielt designet til dette formål. Yderligere billede analyse kunne også være kilden til nye protokoller udvikling, som søger at minimere fejl.
Brissel er det organ, hvor alle T-celler er produceret, og derfor er det organ, hvor immunologer interesseret i at forstå den generation af γδ, vil CD4 eller CD8 T-celler fokuserer deres opmærksomhed. De fleste undersøgelser om T-cellerne er baseret på forskelle i antal og / eller stabilitet af disse calen efter forskellige in vitro / in vivo manipulationer. Men først efter in vivo-visualiseringen kunne vi iagttage samspillet mellem celler i immunsystemet, der er involveret i at opretholde homøostase 3-7. Derfor er in vivo observation af thymocytter er sandsynligvis en af de vigtigste manglende oplysninger til bedre at forstå T-celle-biologi. Intravital TPM giver et detaljeret billede af T-celle bevægelser og interaktioner, og vi viser her, hvordan det kan anvendes til detaljerede thymocyt studier. Men hver teknik har sine begrænsninger. Mens intravital imaging Overtagelsestidspunktet er det mest præcise system til reflekterende celler adfærd inde i kroppen, er det også sandt, at eksplanterede billede erhvervelse af organer er mindre omstændelig og har været anvendt til at indsamle vigtige oplysninger om immunsystemet 8,9. Desuden kan man ikke benægte intravital billeddiagnostiske metoder kræver operation for at eksponere væv og blodkar i bedøvede dyr,som i sig selv kan forårsage en ændring i hele orglet fysiologi 10. Alligevel er der non-invasivt metoder, der afskaffe artefakter som følge af den kirurgiske procedure 11 og nye metoder er blevet udviklet, at bedre at forberede på forhånd de dyr, der skal bruges 12. Derfor vil nye kirurgiske indgreb og vejafgifter minimere eller bypass faktiske begrænsninger af intravital billedbehandling erhvervelse og blive mere og mere tilgængelig for det videnskabelige samfund.
Vi har vist, at den metode, vi har beskrevet er mulig, og den rapporterer alle in vivo systemisk manipulationer, såsom Drug Administration, som vi har brugt. Derfor foreslår vi, at brugen af denne metode sammen med ex vivo-teknikker allerede er til rådighed med henblik på at supplere og styrke yderligere undersøgelser vedrørende thymocytter udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. David Olivieri til kritisk revision af dette manuskript, Dr. Nuno Moreno for den logistiske bidrage til at opbygge vores dyre-indehaver og varmepuder og Dr. Vijay K. Kuchroo for den type donation af Foxp3-KI GFP / GFP mus. Dette arbejde er støttet af "Fundação para Ciencia e Tecnologia" (FCT, Portugal), give # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml |
Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | |
Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | |
20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | |
Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | |
525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | |
595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | |
565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | |
Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | |
Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | |
ImageJ | NIH, USA | ImageJ |