माउस 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग thymus के intravital इमेजिंग
Summary
हम उपन्यास प्रयोगशाला उपकरणों और thymus के intravital इमेजिंग अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया है. हमारी तकनीक थाइमस जहां टी सेल विकास होता है के भीतर "niches" की पहचान में मदद करनी चाहिए.
Abstract
Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify “niches” inside organs and to document cellular “behaviors” in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel “stereotactic” organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called “naturally-occurring Tregs” (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.
Protocol
Discussion
इस पत्र में हम एक जीवित जानवरों के अंदर thymocytes के दो photon इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया. हम भी कुछ पैरामीटर है कि एक सावधानी से नियंत्रण चाहिए जैसे रक्त के प्रवाह की निरंतरता और इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान अंग तापमान के रखरखाव, वर्णित है. बहरहाल, सावधान अंग को स्थिर रखने के प्रयासों के बावजूद, "अंग बहती" के रूप में गति कलाकृतियों हो सकता है. पोस्टीरियर छवि सुधार विशेष रूप से इस प्रयोजन के लिए डिजाइन एल्गोरिदम के विकास के द्वारा किया जा सकता है. इसके अलावा छवि विश्लेषण भी नए प्रोटोकॉल के विकास का स्रोत है जो त्रुटियों को कम करना चाहता है हो सकता है.
थाइमस जहां सभी टी कोशिकाओं का उत्पादन कर रहे हैं, इसलिए अंग है, यह अंग जहां प्रतिरक्षाविज्ञानी γδ की पीढ़ी को समझने में दिलचस्पी है, CD4, या CD8 टी कोशिकाओं अपना ध्यान केंद्रित करेंगे. सबसे टी कोशिकाओं के विषय में अध्ययन की संख्या में मतभेद और / या इन ग के स्थिरता पर आधारित हैं/ इन विट्रो में vivo में जोड़तोड़ में विभिन्न बाद ells. हालाँकि, केवल में vivo दृश्य के बाद हम 3-7 homeostasis को बनाए रखने में शामिल प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के बीच बातचीत का पालन सकता है. इसलिए, thymocytes के vivo अवलोकन में शायद एक सबसे महत्वपूर्ण लापता जानकारी के लिए बेहतर टी कोशिका जीव विज्ञान को समझने की . Intravital TPM टी सेल आंदोलनों और बातचीत का एक विस्तृत चित्र प्रदान करता है और हम यहाँ का प्रदर्शन कैसे यह विस्तृत thymocyte अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हर तकनीक की अपनी सीमाएं है. जबकि intravital इमेजिंग अधिग्रहण शरीर के अंदर की कोशिकाओं के व्यवहार को दर्शाती के लिए सबसे सही प्रणाली है, यह भी सच है कि अंगों की छवि अधिग्रहण explanted कम श्रमसाध्य है और प्रतिरक्षा प्रणाली 8,9 के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी एकत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, एक इनकार नहीं कर सकता intravital तरीकों इमेजिंग सर्जरी की आवश्यकता anesthetized पशुओं में ऊतकों और रक्त वाहिकाओं का पर्दाफाश,से प्रति जो पूरे अंग फिजियोलॉजी 10 में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है. फिर भी, वहाँ गैर invasively तरीकों कि शल्य चिकित्सा प्रक्रिया 11 और नए तरीकों की वजह से कलाकृतियों को समाप्त कर रहे हैं विकसित किया जा रहा हैं कि बेहतर अग्रिम में तैयार 12 इस्तेमाल किया जा पशुओं. इसलिए, नए शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और tolls या कम से कम intravital इमेजिंग अधिग्रहण के वास्तविक सीमाओं बाईपास होगा और अधिक से अधिक वैज्ञानिक समुदाय के लिए सुलभ हो.
हमने दिखा दिया है कि हम विधि वर्णित है संभव है और यह vivo में प्रणालीगत जोड़तोड़, ऐसी दवा प्रशासन में सभी रिपोर्टों, कि हम इस्तेमाल किया है. इस प्रकार, हम इस पद्धति का उपयोग के साथ पूर्व vivo पहले से ही उपलब्ध तकनीक के साथ क्रम में करने के लिए पूरक हैं और आगे thymocytes विकास के विषय में अध्ययन को मजबूत सुझाव है.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा, डा. Nuno मोरेनो के लिए रसद Foxp3 की GFP / GFP की तरह के दान के लिए हमारे पशु धारक और हीटिंग पैड और डॉ. विजय कुमार Kuchroo बनाने में मदद के लिए धन्यवाद डॉ. डेविड Olivieri करना चाहते हैं चूहों. यह काम "Fundação पैरा Ciência ई TECNOLOGIA" (FCT, पुर्तगाल), अनुदान PTDC/EBB-BIO/115514/2009 # द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | |
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | |
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | |
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | |
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | |
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | |
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | |
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | |
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | |
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
Referências
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