Визуализация сосудистой Са 2 + Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS
Summary
Эффективный способ получить представление о визуализации паракринной полученных АФК индукцию эндотелиальной Ca2 + сигнализация описано. Этот метод использует измерения паракринной производных АФК вызвало мобилизацию Са 2 + в сосудистых эндотелиальных клеток в культуре со-модели.
Abstract
Окислительный стресс был замешан в целом ряде патологических состояний, в том числе при ишемии / реперфузионного повреждения и сепсис. Концепция окислительного стресса относится к аберрантных образования АФК (активные формы кислорода), которые включают O 2 • -, Н 2 О 2, и гидроксильные радикалы. Активные формы кислорода влияет множество клеточных процессов, включая передачу сигналов, клеточной пролиферации и гибели клеток 1-6. АФК имеют потенциал для повреждения сосудов и клеток непосредственно органом, и может инициировать вторичных химических реакций и генетических изменений, которые в конечном итоге привести к усилению начальной РОС-опосредованного повреждения тканей. Ключевым компонентом усиления каскад, который усиливает необратимое повреждение ткани найма и активации циркулирующих воспалительных клеток. Во время воспаления, воспалительные клетки вырабатывают цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (ФНО) и ИЛ-1, чтоактивации эндотелиальных клеток (ЭК) и эпителиальных клеток и дальнейшего расширения воспалительного ответа 7. Сосудистой дисфункции эндотелия является признанным особенностью острого воспаления. Макрофаги способствуют дисфункции эндотелия при воспалении с помощью механизмов, остаются неясными. Активация макрофагов приводит к внеклеточной выпуск O 2 • – и различных провоспалительных цитокинов, который вызывает патологические сигнализации в соседние ячейки 8. NADPH оксидазы являются основным и главным источником АФК в большинстве типов клеток. В последнее время показано нами и другими 9,10, что АФК производства NADPH оксидазы вызвать митохондриальную производства АФК в течение многих патофизиологических условиях. Поэтому измерения митохондриальной производства АФК не менее важно в дополнение к оценке цитозольного АФК. Макрофаги производства АФК по NADPH флавопротеидом фермент который играет главную роль в воспалении. После активации,фагоцитарной NADPH оксидазы производит обильное количество O 2 • – которые имеют важное значение в механизме защиты организма 11,12. Хотя паракринной производных O 2 • – играет важную роль в патогенезе сосудистых заболеваний, визуализация паракринной РОС-индуцированных внутриклеточных сигнальных том числе Са 2 + мобилизации до сих пор гипотезы. Мы разработали модель, в которой активированными макрофагами используются в качестве источника O 2 • – для трансдукции сигнала на соседние эндотелиальные клетки. Используя эту модель, мы показываем, что макрофаг происхождения O 2 • – привести к кальциевой сигнализации в соседних эндотелиальных клеток.
Protocol
Discussion
Описанный здесь метод позволяет быстро и количественного измерения активных форм кислорода в живых клетках, либо с помощью окисления чувствительных красителей или плазмиды датчиков. Агонисты TLRs (звонок-подобных рецепторов) являются соединениями, которые стимулируют клетки через TLRs ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) в ММ. Наша статья частично поддержана Carl Zeiss Microimaging LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Referências
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
