Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal
Summary
Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.
Abstract
Oksidatif stres, iskemi / reperfüzyon hasarı ve sepsis de dahil olmak üzere bir dizi patolojik durumların oluşmasında rol oynar. H 2 O 2 ve hidroksil radikalleri oksidatif stres kavramı O 2 • ROS (reaktif oksijen türleri), anormal oluşumunu ifade eder . Reaktif oksijen türleri, sinyal iletimi, hücre proliferasyonu ve hücre ölümü 1-6 da dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçleri etkiler. ROS doğrudan damar ve organ hücreleri hasar potansiyeline sahiptir ve sonuçta ilk ROS aracılı doku hasarının bir amplifikasyon sonucu ikincil kimyasal reaksiyonlar ve genetik değişiklikler başlatabilir. Geri dönüşümsüz doku hasarı exacerbates amplifikasyon kaskadın temel bileşeni dolaşımdaki inflamatuar hücreler işe alma ve aktivasyon. Inflamasyon sırasında, inflamatuar hücreler, tümör nekroz faktörü-α (TNF) ve IL-1 gibi sitokinler üretirendotel hücreleri (EC) ve epitel hücreleri aktif hale getirmek ve daha fazla inflamatuvar yanıt 7 arttırır. Vasküler endotel disfonksiyonu, akut inflamasyon kurulmuş bir özelliktir. Makrofajlar belirsizdir mekanizmaları tarafından inflamasyon sırasında endotel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. • – komşu hücreler patolojik sinyalizasyon 8 tetikler ve çeşitli pro-inflamatuvar sitokinler, O 2 ekstraselüler sürümde makrofaj aktivasyonu sonuçları. NADPH oksidaz hücre tiplerinin çoğu ROS en önemli ve birincil kaynak. Son zamanlarda, biz ve diğerleri 9,10 tarafından NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS mitokondriyal ROS üretimi sırasında birçok fizyopatolojik koşullardaki neden olduğu gösterilmiştir . Bu nedenle mitokondriyal ROS üretimi sitozolik ROS ölçmek için ek olarak ölçüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar inflamasyon birincil rol oynar flavoprotein NADPH oksidaz enzimi tarafından ROS üretir. Bir kez aktivefagositik NADPH oksidaz bol miktarda O 2 • üretir ana savunma mekanizması 11,12 önemlidir. Parakrin-kökenli O 2 • rağmen – damar hastalıkları, Ca 2 de dahil olmak üzere parakrin ROS-kaynaklı hücre içi sinyal görselleştirme patogenezinde önemli bir rol oynar + seferberlik hala hipotezdir. – Biz, komşu endotel hücreleri için bir sinyal uyum sağlamak aktive makrofajlar, O 2 kaynağı • olarak kullanıldığı bir model geliştirdik. Komşu endotel hücreleri sinyal kalsiyum neden bu modeli kullanarak, makrofaj kaynaklı O 2 • göstermektedir.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan yöntem hücreli canlılar ya oksidasyona hassas boyalar veya plazmid sensörleri kullanarak reaktif oksijen türlerinin hızlı ve kantitatif ölçüm sağlar. TLR agonistleri (Toll-benzeri reseptörler), hücre yüzeyinde bulunan TLR aracılığıyla hücrelerini uyarmak ve downstream sinyal yollar 15 tetikleyebilir bileşiklerdir . Protokolde, biz üç farklı TLR agonistleri yani, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist; Poli (I: C). TLR3 agonist; ROS ölçüm göstermek için bir model sistem ol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, MM için, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (HL086699 R01, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) tarafından desteklenmiştir. Bizim makale kısmen Carl Zeiss Microimaging LLC tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Referências
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
