혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호
Summary
내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.
Abstract
산화 스트레스는 국소 빈혈 / reperfusion 손상과 패혈증을 포함한 pathologic 조건의 숫자에 연루되었습니다. , H 2 O 2, 및 수산기 래디 칼 – 산화 스트레스의 개념은 O 2 • 포함 ROS의 비정상적 형성 (반응 산소 종)를 말합니다. 반응 산소 종은 신호 전달, 세포 증식 및 세포 사망을 포함하여 1-6 세포 프로세스의 다수에 영향을 미칩니다. ROS는 직접 혈관과 장기의 세포를 손상 가능성을 가지고 있고, 궁극적으로 초기 ROS – 인한 조직 손상의 증폭의 결과 보조 화학 반응과 유전자 변경을 시작할 수 있습니다. 돌이킬 수없는 조직의 손상을 exacerbates 증폭 캐스케이드의 핵심 구성 요소는 염증 세포를 순환의 모집 및 활성화됩니다. 염증 동안, 염증 세포는 종양 괴사 인자 – α (TNFα)와 IL – 1 것과 크린 시토킨 생산내피 세포 (EC)와 상피 세포를 활성화하고 추가로 염증 반응 7 확대. 혈관 내피 기능 장애는 급성 염증의 설립 기능입니다. Macrophages가 불분명 메커니즘에 의해 염증 동안 내피 부전에 기여한다. O 2의 세포 릴리스에 macrophages 결과의 활성화 • – 인접 세포에 pathologic 신호 8 트리거 및 다양한 프로 염증성 크린 시토킨. NADPH의 oxidases은 세포 유형의 대부분 ROS의 전공 및 기본 소스입니다. 최근에, 그것은 NADPH의 oxidases에 의해 만들어진 ROS는 많은 pathophysiological 조건 중에 mitochondrial ROS 생산을 유도 것을 우리와 다른 9,10에 의해 표시됩니다. 따라서 mitochondrial ROS 생산을 측정하는 것은 cytosolic ROS를 측정 이외에 똑같이 중요합니다. Macrophages는 염증에 중요한 역할을 담당 flavoprotein의 효소 NADPH 산화 효소에 의해 ROS를 생성합니다. 일단 활성화,phagocytic NADPH 산화 효소는 O 2 •의 풍부한 양의 생산 – 호스트 방어 메커니즘 11,12에 중요하다는 것을. paracrine – 파생 O 2 •이 있지만 – 혈관 질환, CA 2를 포함하여 paracrine ROS 유도된 세포 내 신호의 시각화의 pathogenesis에 중요한 역할을 + 동원은 아직 가설이다. 인접한 내피 세포에 신호를 transduce에 – 우리는 활성화 macrophages는 O 2의 소스 • 사용되는 모델을 개발했습니다. 인접한 내피 세포에 신호 칼슘을 초래할 -이 모델을 사용 우리가 O 2 •이 대식 세포 – 파생 보여줍니다.
Protocol
Discussion
방법은 세포를 살아있는 하나 산화에 민감한 염료 또는 플라스미드 센서를 사용하여 반응 산소 종의 신속하고 양적 측정이 가능합니다 여기에 설명했다. TLRs의 Agonists (수신자 같은 수용체)는 세포 표면에 존재하는 TLRs를 통해 세포를 자극하고 다운 스트림 신호 경로 15 트리거 화합물입니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 세 가지 다른 TLR의 agonists의 즉 사용, Lipo – teichoic 산 – TLR2 작용제,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 MM에 보건 부여의 국립 연구소 (R01 HL086699, HL086699 – 01A2S1, 1S10RR027327 – 01)에 의해 지원되었다. 우리의 문서는 부분적으로 칼 자이스 혈구 Microimaging LLC에 의해 지원됩니다.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Referências
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