Эффективный способ получить представление о визуализации паракринной полученных АФК индукцию эндотелиальной Ca2 + сигнализация описано. Этот метод использует измерения паракринной производных АФК вызвало мобилизацию Са 2 + в сосудистых эндотелиальных клеток в культуре со-модели.
Окислительный стресс был замешан в целом ряде патологических состояний, в том числе при ишемии / реперфузионного повреждения и сепсис. Концепция окислительного стресса относится к аберрантных образования АФК (активные формы кислорода), которые включают O 2 • -, Н 2 О 2, и гидроксильные радикалы. Активные формы кислорода влияет множество клеточных процессов, включая передачу сигналов, клеточной пролиферации и гибели клеток 1-6. АФК имеют потенциал для повреждения сосудов и клеток непосредственно органом, и может инициировать вторичных химических реакций и генетических изменений, которые в конечном итоге привести к усилению начальной РОС-опосредованного повреждения тканей. Ключевым компонентом усиления каскад, который усиливает необратимое повреждение ткани найма и активации циркулирующих воспалительных клеток. Во время воспаления, воспалительные клетки вырабатывают цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (ФНО) и ИЛ-1, чтоактивации эндотелиальных клеток (ЭК) и эпителиальных клеток и дальнейшего расширения воспалительного ответа 7. Сосудистой дисфункции эндотелия является признанным особенностью острого воспаления. Макрофаги способствуют дисфункции эндотелия при воспалении с помощью механизмов, остаются неясными. Активация макрофагов приводит к внеклеточной выпуск O 2 • – и различных провоспалительных цитокинов, который вызывает патологические сигнализации в соседние ячейки 8. NADPH оксидазы являются основным и главным источником АФК в большинстве типов клеток. В последнее время показано нами и другими 9,10, что АФК производства NADPH оксидазы вызвать митохондриальную производства АФК в течение многих патофизиологических условиях. Поэтому измерения митохондриальной производства АФК не менее важно в дополнение к оценке цитозольного АФК. Макрофаги производства АФК по NADPH флавопротеидом фермент который играет главную роль в воспалении. После активации,фагоцитарной NADPH оксидазы производит обильное количество O 2 • – которые имеют важное значение в механизме защиты организма 11,12. Хотя паракринной производных O 2 • – играет важную роль в патогенезе сосудистых заболеваний, визуализация паракринной РОС-индуцированных внутриклеточных сигнальных том числе Са 2 + мобилизации до сих пор гипотезы. Мы разработали модель, в которой активированными макрофагами используются в качестве источника O 2 • – для трансдукции сигнала на соседние эндотелиальные клетки. Используя эту модель, мы показываем, что макрофаг происхождения O 2 • – привести к кальциевой сигнализации в соседних эндотелиальных клеток.
Описанный здесь метод позволяет быстро и количественного измерения активных форм кислорода в живых клетках, либо с помощью окисления чувствительных красителей или плазмиды датчиков. Агонисты TLRs (звонок-подобных рецепторов) являются соединениями, которые стимулируют клетки через TLRs ?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранта (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) в ММ. Наша статья частично поддержана Carl Zeiss Microimaging LLC.
Reagent | Company | Catalogue number |
Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
G418 | Invitrogen | 10131-027 |
Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
T-25 Flasks | Corning | 430639 |
T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |