Visualisering av Vascular Ca 2 + Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS
Summary
En effektiv metod för att få insikt i att visualisera parakrina-derived ROS induktion av endotel Ca2 +-signalering beskrivs. Denna metod tar fördel av att mäta parakrina härrör ROS utlöste Ca2 + mobilisering i vaskulära endotelceller i en co-kultur-modellen.
Abstract
Oxidativ stress har varit inblandad i ett antal patologisk tillstånd inklusive ischemi / reperfusion skador och sepsis. Begreppet oxidativ stress hänvisar till avvikande bildningen av ROS (reaktivt syre arter), som inkluderar O 2 • -, H 2 O 2, och hydroxylradikaler. Reaktiva syreradikaler påverkar en mängd olika cellulära processer, inklusive signaltransduktion, celltillväxt och celldöd 1-6. ROS har potential att skada kärl och celler orgel direkt, och kan initiera sekundära kemiska reaktioner och genetiska förändringar som i slutändan leder till en förstärkning av den initiala ROS-medierad vävnadsskada. En viktig del av förstärkningen kaskad som förvärrar irreversibla vävnadsskador är rekrytering och aktivering av cirkulerande inflammatoriska celler. Under inflammation, inflammatoriska celler producerar cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF) och IL-1 somaktivera endotelceller (EG) och epitelceller och ytterligare förstärka det inflammatoriska svaret 7. Vascular endothelial dysfunktion är ett etablerat inslag av akut inflammation. Makrofager bidra till endoteldysfunktion vid inflammation av mekanismer som fortfarande oklara. Aktivering av makrofager resulterar i det extracellulära utsläpp av O 2 • – och olika pro-inflammatoriska cytokiner, som triggar patologiska signalering i angränsande celler 8. NADPH oxidases är de stora och primära källan för ROS i de flesta celltyper. Nyligen visas det av oss och andra 9,10 som ROS produceras av NADPH oxidases förmå mitokondriella ROS-produktion under många patofysiologiska förhållanden. Därför mätning av mitokondriella ROS-produktionen är lika viktigt Förutom att mäta cytosoliska ROS. Makrofager producerar ROS av flavoprotein enzymet NADPH-oxidas som spelar en central roll i inflammation. När den är aktiveradfagocytiska NADPH-oxidas producerar stora mängder av O 2 • – som är viktiga i den mottagande försvarsmekanism 11,12. Även parakrina-derived O 2 • – spelar en viktig roll i patogenesen av vaskulära sjukdomar, visualisering av parakrina ROS-inducerad intracellulär signalering inklusive Ca 2 + mobilisering är fortfarande hypotes. Vi har utvecklat en modell där aktiverade makrofager används som en källa till O 2 • – att transduce en signal till angränsande endotelceller. Med hjälp av denna modell visar vi att makrofager som härrör O 2 • – leda till kalcium signalering i angränsande endotelceller.
Protocol
Discussion
Den metod som beskrivs här tillåter snabb och kvantitativ mätning av reaktiva syreradikaler i levande celler, antingen med hjälp av oxidation känsliga färgämnen eller plasmid sensorer. Agonister av TLRs (Toll-liknande receptorer) är föreningar som stimulerar cellerna via TLRs som finns på cellytan och utlösa nedströms signalvägar 15. I vårt protokoll, använde vi tre olika TLR-agonister nämligen, Lipo-teichoic syra-TLR2 agonist, Poly (I: C).-TLR3 agonist, LPS-TLR4 agonist som rapporteras att in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) till MM. Vår artikel är delvis stöds av Carl Zeiss mikrovisualisering LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Referências
- Madesh, M. Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis. J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .
- Hawkins, B. J. S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis. J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).
- Madesh, M., Hajnoczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. Harmful molecular mechanisms in sepsis. Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).
- Sanlioglu, S. Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa. 276, 30188-30198 (2001).
- Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling. Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).
- Vliet, A. v. a. n. d. e. r. NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more. Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).
- Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).
- Lambeth, J. D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).
- Mukhopadhyay, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459, 996-999 (2009).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
