Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)
Summary
Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.
Abstract
In den letzten fünfzehn Jahren die Vorstellung, dass die Zellmembranen nicht homogen sind und sich auf Mikrodomänen, um ihre Funktionen ausüben, hat sich weitgehend akzeptiert. Lipid Rafts sind Mikrodomänen in Cholesterin und Sphingolipiden angereichert. Sie spielen eine Rolle bei der zellulären physiologischen Prozessen, wie Signal-, und Menschenhandel 1,2 sind aber auch gedacht, um wichtige Akteure in mehreren Krankheiten, darunter viralen oder bakteriellen Infektionen und neurodegenerativen Erkrankungen 3 sein.
Doch ihre Existenz ist noch immer umstritten 4,5. In der Tat hat Lipidfloß Größe geschätzt auf rund 20 nm 6 sein, weit unter der Auflösungsgrenze des konventionellen Mikroskopie (ca. 200 nm) und somit kein Direct Imaging. Bis jetzt waren die wichtigsten Techniken verwendet, um die Partition von interessierenden Proteinen in Lipid Rafts beurteilen Waschmittel resistenten Membranen (DRM) Isolierung und Co-Patching mit Antikörpern. Obwohl weit verbreitet becaNutzung ihrer eher einfache Implementierung, waren diese Techniken anfällig für Artefakte und damit 7,8 kritisiert. Technische Verbesserungen seien daher notwendig, um diese Artefakte zu überwinden und in der Lage, Lipid Rafts-Partition in lebenden Zellen zu untersuchen.
Hier präsentieren wir eine Methode für die empfindliche Analyse der Lipid Rafts Partition von fluoreszenz-markierte Proteine oder Lipide in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Diese Methode, genannt Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), stützt sich auf die Unterschiede in der Diffusionszeit von fluoreszierenden Sonden innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. In der Tat, da in beiden künstlicher Membranen und Zellkulturen nachgewiesen, würde Sonden diffundieren viel schneller außen als von innen dichten Lipidflößen 9,10. Um die Diffusion Zeiten zu bestimmen, winzigen Fluoreszenzfluktuationen als Funktion der Zeit in einem Fokalvolumen (etwa 1 Femtoliter) gemessen wird, liegt an der Plasmamembran von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (Abb.1). Die Autokorrelation Kurven kann dann aus diesen Schwankungen gezogen werden und mit geeigneten mathematischen Modellen Diffusion 11.
FCS kann die Lipidfloß Partitionierung der verschiedenen Sonden, solange sie fluoreszierend markiert sind zu bestimmen. Fluoreszenzmarkierung kann durch Expression von fluoreszierenden Fusionsproteine oder durch Bindung von fluoreszierenden Liganden erreicht werden. Darüber hinaus kann nicht nur in FCS künstlicher Membranen und Zelllinien, sondern auch in primären Kulturen verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 12. Es kann auch verwendet werden, um die Dynamik des Lipidfloß Unterteilung nach Drogenabhängigkeit oder Membranlipid Änderung der Zusammensetzung 12 folgen werden.
Protocol
Discussion
Der FCS hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sensitive und schnelle Analyse der Lipid Raft Partitionierung von fluoreszierenden Sonden von Interesse in lebenden Zellen. FCS kombiniert die Genauigkeit der Lokalisierung der konfokalen Mikroskopie mit der Empfindlichkeit des Einzelphotonenzählung. Der Hauptunterschied zwischen FCS und biochemischen Standardtechniken ist, dass die FCS absolute Bestimmung der Lipid-Rafts Partition des Ziels und nicht die relative Partition ermöglicht wie es der Fall für DRM-Systeme …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) unterstützt. Wir sind auch dankbar, dass der Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) für ihre finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
Referências
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