Spectral confocal Imaging av fluorescently tagget nikotinreseptorene i Knock-in Mus med kronisk Nikotin Administrasjon

Summary

Vi har utviklet en ny metode for å kvantifisere nikotin acetylkolin reseptor endringer innenfor subcellulære regioner i bestemte undergrupper av CNS neurons å bedre forstå mekanismene for nikotinavhengighet ved hjelp av en kombinasjon av tilnærminger, inkludert fluorescerende protein merking av reseptoren med knock-in tilnærming og spektrale confocal bildebehandling.

Abstract

Ligand-gated ionekanaler i sentralnervesystemet (CNS) er innblandet i en rekke tilstander med alvorlige medisinske og sosiale konsekvenser. For eksempel, er avhengighet av nikotin via tobakksrøyking en ledende årsak til for tidlig død på verdensbasis (World Health Organization) og er sannsynligvis forårsaket av en endring av ionekanal fordeling i hjernen ^en. Kronisk nikotin eksponering i både gnagere og mennesker gir økte antall nikotin acetylkolinreseptorer (nAChRs) i hjernevev ^1-3. Tilsvarende har endringer i de glutamatergic GluN1 eller GluA1 kanaler vært innblandet i å utløse overfølsomhet mot andre avhengighetsskapende stoffer som kokain, amfetamin og opiater ^4-6.

Derfor er evnen til å kartlegge og kvantifisere distribusjon og uttrykk mønstre av spesifikke ionekanaler kritisk viktig å forstå mekanismene for avhengighet. Studiet av hjernen region-spesifikk efvirkningene av enkelte legemidler ble fremmet ved ankomsten av teknikker som radioaktive ligander. Imidlertid hindrer lav romlig oppløsning av radioaktivt ligand binding muligheten til å kvantifisere ligand-gated ionekanaler i bestemte undergrupper av nerveceller.

Genetisk kodet fluorescerende reportere, som for eksempel grønn fluorescerende protein (GFP) og sine mange fargevarianter, har revolusjonert innen biologi ^7. Ved genetisk tagging en fluorescerende reporter til en endogen protein man kan visualisere proteiner in vivo ^7-10. En fordel med fluorescently tagging proteiner med en sonde er eliminering av antistoff bruk, som har spørsmål om nonspecificity og tilgjengelighet til målet protein. Vi har brukt denne strategien for å fluorescently label nAChRs, som gjorde studiet av reseptoren montering bruke Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterte dyrkede celler ^11. Mer nylig har vi brukt knock-i tilnærming til ingeniør mus med gul fluoriserende protein tagget α4 nAChR subenheter (α4YFP), slik at nøyaktig kvantifisering av reseptoren ex vivo ved submicrometer oppløsning i CNS nevroner via spektral konfokalmikroskopi ^12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutasjon er innlemmet i den endogene locus og under kontroll av sin opprinnelige arrangøren, produserer normale nivåer av uttrykk og regulering av reseptoren i forhold til ukodede reseptorer i hvete mus. Dette knock-in tilnærming kan utvides til fluorescently tagge andre ionekanaler, og tilbyr en kraftig tilnærming av visualisere og kvantifisere reseptorer i CNS.

I dette notatet beskriver vi en metode for å kvantifisere endringer i nAChR uttrykk i spesifikke CNS nevroner etter eksponering til kronisk nikotin. Våre metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantasjon, intrakardiale perfusjon fiksering, bildebehandling og analyse av fluorescently merket nikotinsyre receptor subenheter fra α4YFP knock-in mus (Fig. 1). Vi har optimalisert fiksering teknikken for å minimere autofluorescens fra fast hjernen tissue.We beskrive i detalj vår avbildning metodikk ved hjelp av en spektral confocal mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme for å trekke autofluoresent signal for å oppnå nøyaktig α4YFP fluorescens signal. Til slutt viser vi resultater av kronisk nikotin-indusert oppregulering av α4YFP reseptorer i den mediale perforant banen til hippocampus.

Protocol

1. Pump implantasjon Før pumpen implantasjon, fyll og forberede Alzet mini-osmotiske pumper (Alzet, 2002 Modell, Cupertino, USA) er forsiktig å ikke innføre luftbobler. Denne modellen av mini-osmotisk pumpe leverer løsningen med en rate på 0,5 mL / t i 14 dager. Sørg for sterile forhold. Vei tomme og fylt pumper. Ved avslutningen av forsøket (10 dager etter implantasjon), kan de resterende væske i pumpen fjernes med en sprøyte og kanyle og veide for å beregne volumet pumpes. Pumper med kon…

Discussion

<p class="jove_content"> Bruk av en fluorescerende reseptor i en knock-in mus modell for å bestemme mengde og lokalisering av et bestemt ion kanal gir en rekke fordeler. I motsetning til proteiner som aktin, som er overalt uttrykt i alle celler, ionekanaler er tilstede i langt færre antall og deres uttrykk varierer mellom nevrale subtyper gjør nøyaktig analyse via tradisjonelle immunhistokjemiske teknikker utfordrende. Den α4YFP genproduktet er uttrykt i WT nivåer, å være under kontroll av de samme arrangører, enhancers og handel me…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
mini-osmotic pumps	Alzet	model 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt	Sigma	N5260
eye drops	Novartis	Tear-Gel
Vetbond glue	3M	1469SB
heparin sodium salt	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
ketamine	Wyeth Animal Health	0856-4403-01
medatomidine hydrochloride	Pfizer	1950673
23G butterfly needle	Becton Dickinson	367253
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
plastic embedding mold	VWR	18986-1
O.C.T. Mounting Compound	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8.5