Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina
Summary
Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.
Abstract
Ligand-canali ionici nel sistema nervoso centrale (CNS) sono coinvolti in numerose condizioni con gravi conseguenze mediche e sociali. Per esempio, la dipendenza da nicotina tramite il fumo di tabacco è la principale causa di morte prematura in tutto il mondo (World Health Organization) ed è probabilmente causato da un'alterazione della distribuzione dei canali ionici nel cervello 1. L'esposizione cronica alla nicotina sia nei roditori e nell'uomo i risultati in aumento del numero di recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR) nei tessuti cerebrali 1-3. Allo stesso modo, alterazioni nei glutamatergici GluN1 o GluA1 canali sono stati implicati nello scatenare sensibilizzazione ad altre sostanze stupefacenti come la cocaina, anfetamine e oppiacei 4-6.
Di conseguenza, la capacità di mappare e quantificare i modelli di distribuzione e di espressione di specifici canali ionici è di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi della dipendenza. Lo studio del cervello specifica di un'area efGli effetti di singoli farmaci è stata avanzata con l'avvento di tecniche come ligandi radioattivi. Tuttavia, la bassa risoluzione spaziale di legame ligando radioattivo impedisce la possibilità di quantificare ligando canali ionici in specifici sottotipi di neuroni.
Geneticamente codificati reporter fluorescenti, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue molte varianti di colore, hanno rivoluzionato il campo della biologia 7. Con tagging geneticamente un reporter fluorescente ad una proteina endogena è possibile visualizzare le proteine in vivo 7-10. Un vantaggio di proteine fluorescenti etichettatura con una sonda è l'eliminazione dell'uso di anticorpo, che hanno il problema della aspecificità e accessibilità alla proteina bersaglio. Abbiamo usato questa strategia per fluorescente nAChRs etichette, che hanno permesso lo studio di montaggio del recettore con Förster Resonance Energy Transfer (FRET) trasfettate in cellule in coltura 11. Più recentemente, abbiamo usato il Knock-in approccio alla topi ingegnere con giallo proteina fluorescente con tag a4 subunità nAChR (α4YFP), che consente una precisa quantificazione del recettore ex vivo a risoluzione submicrometer nei neuroni del SNC attraverso la microscopia confocale spettrale 12. Il mirata fluorescente knock-in mutazione è incorporato nel locus endogeno e sotto il controllo del suo promotore nativo, producendo normali livelli di espressione e regolazione del recettore rispetto ai recettori untagged nei topi di tipo selvatico. Il knock-in approccio può essere esteso per codificare fluorescente altri canali ionici e offre un approccio efficace di visualizzazione e quantificare i recettori nel SNC.
In questo articolo descriviamo una metodologia per quantificare i cambiamenti nell'espressione nAChR in specifici neuroni del sistema nervoso centrale dopo l'esposizione cronica alla nicotina. I nostri metodi includono mini-pompa osmotica l'impianto, la fissazione perfusione intracardiaca, imaging e analisi di fluorescenza tagged rec nicotinicosubunità eptor da α4YFP topi knock-in (Fig. 1). Abbiamo ottimizzato la tecnica di fissazione per minimizzare autofluorescenza da tissue.We cervello fisso descrivere in dettaglio la metodologia di immagini utilizzando un microscopio confocale spettrale in combinazione con un algoritmo lineare unmixing spettrale per sottrarre il segnale autofluoresent per ottenere con precisione α4YFP segnale di fluorescenza. Infine, mostrare i risultati di nicotina cronica indotta upregulation dei recettori α4YFP nel percorso perforante mediale dell'ippocampo.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Antonio Renda è stata sostenuta da una Università di Victoria Graduate Fellowship Award. Questa ricerca è stata sostenuta da un scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada Discovery Grant, uno NARSAD Young Investigator Award (per RN), una Fondazione Victoria – Myre e Winifred Sim Fund, una Fondazione canadese per l'innovazione sovvenzione, un Fondo di conoscenza Columbia Britannica per lo sviluppo e scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada strumenti di ricerca e Grant Strumentazione. Ringraziamo Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald e Daniel Morgado per l'allevamento del mouse eccellente.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
Referências
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