Spektral Confocal avbildning av fluorescensmärkta nikotinreceptorer i Knock-in Möss med kronisk Nikotin Administration

Summary

Vi har utvecklat en ny teknik att kvantifiera nikotin förändringar acetylkolin receptor inom subcellulära regioner i vissa subtyper av CNS-neuroner för att bättre förstå mekanismerna bakom nikotinberoende med hjälp av en kombination av metoder, bland annat fluorescerande proteinet märkning av receptorn med hjälp av knock-in och spektrala konfokal bildalstring.

Abstract

Ligand-jonkanaler i det centrala nervsystemet (CNS) är inblandade i många förhållanden med allvarliga medicinska och sociala konsekvenser. Till exempel är beroende av nikotin via tobaksrökning en ledande orsak till för tidig död i världen (World Health Organization) och troligt orsakat av en förändring av jonkanal fördelning i hjärnan ^1. Kronisk exponering för nikotin i både gnagare och människor resulterar i ett ökat antal nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) i hjärnvävnad ^1-3. På samma sätt har förändringar i de glutamaterga GluN1 eller GluA1 kanaler varit inblandad i att utlösa sensibilisering mot andra beroendeframkallande droger som kokain, amfetamin och opiater ^4-6.

Följaktligen är förmågan att kartlägga och kvantifiera distribution och expression mönster av specifika jonkanaler kritiskt viktiga för att förstå mekanismerna för missbruk. Studiet av hjärnan regionspecifik effekter av enskilda läkemedel framfördes av tillkomsten av tekniker såsom radioaktiva ligander. Emellertid förhindrar den låga spatiala upplösningen av radioaktiv ligand-bindning förmågan att kvantifiera ligandstyrda jonkanaler i specifika undertyper av neuroner.

Genetiskt kodade fluorescerande reportrar, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och dess många varianter färg, har revolutionerat området biologi ^7. Genom att genetiskt märka en fluorescerande reporter till ett endogent protein kan man visualisera proteiner in vivo ^7-10. En fördel med fluorescerande märkning proteiner med en sond är att eliminera antikroppar används, som har frågor om specificitet och tillgängligheten till målproteinet. Vi har använt denna strategi för att fluorescerande märka nAChRs, vilket gjorde att studien av receptorn montering med Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterade odlade celler ^11. På senare tid har vi använt knock-in att konstruera möss med gula fluorescerande proteinet taggade a4 nAChR subenheter (α4YFP), vilket möjliggör exakt kvantifiering av receptorn ex vivo vid submikrometer upplösning i CNS-neuroner via spektrala konfokalmikroskopi ^12. Den riktade fluorescerande knock-in mutation ingår i det endogena stället och under kontroll av dess naturliga promotor, som producerar normala nivåer av uttryck och reglering av receptorn jämfört med otaggade receptorer i vildtyp möss. Detta knock-in kan utvidgas till fluorescerande märka andra jonkanaler och erbjuder en kraftfull strategi för att visualisera och kvantifiera receptorer i CNS.

I denna uppsats beskriver vi en metod för att kvantifiera förändringar i nAChR uttryck i specifika CNS neuroner efter exponering för kroniska nikotin. Våra metoder innefattar mini-osmotisk pump implantation intrakardiell perfusion fixering, avbildning och analys av fluorescensmärkta nikotinsyra RECeptor subenheter från α4YFP knock-in-möss (figur 1). Vi har optimerat fixeringen tekniken för att minimera autofluorescens från fast hjärnan tissue.We i detalj beskriva vårt avbildning metodik med hjälp av en spektral konfokalmikroskop i samband med en linjär spektral unmixing algoritm för att subtrahera autofluoresent signal för att exakt få α4YFP fluorescenssignal. Slutligen visar vi resultatet av kronisk nikotin-inducerad uppreglering av α4YFP receptorer i den mediala perforanta banan av hippocampus.

Protocol

1. Pumpen implantering Innan pumpen implantation, fylla och förbereda Alzet mini-osmotiska pumpar (Alzet, 2002 modell, Cupertino, USA) är noga med att inte införa luftbubblor. Denna modell av mini-osmotisk pump avger lösning vid en hastighet av 0,5 | il / h under 14 dagar. Se sterila betingelser. Väg tomma och fyllda pumpar. Vid avslutningen av experimentet (10 dagar efter implantation), kan den återstående vätskan i pumpen tas bort med en spruta och nål och vägdes för att beräkna den volym som pu…

Discussion

<p class="jove_content"> Användningen av en fluorescerande receptor i en knock-i mus-modell för att bestämma mängden och lokaliseringen av en specifik jon-kanal erbjuder ett antal fördelar. I motsats till proteiner såsom aktin, som överallt uttrycks i alla celler, jonkanaler är närvarande i mycket färre antal och deras expression varierar mellan neuronala subtyper gör noggrann analys via traditionella immunhistokemiska tekniker utmanande. Den α4YFP genprodukten uttrycks vid WT nivåer, som är under kontroll av samma promotorer, …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
mini-osmotic pumps	Alzet	model 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt	Sigma	N5260
eye drops	Novartis	Tear-Gel
Vetbond glue	3M	1469SB
heparin sodium salt	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
ketamine	Wyeth Animal Health	0856-4403-01
medatomidine hydrochloride	Pfizer	1950673
23G butterfly needle	Becton Dickinson	367253
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
plastic embedding mold	VWR	18986-1
O.C.T. Mounting Compound	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8.5