Vi har utvecklat en ny teknik att kvantifiera nikotin förändringar acetylkolin receptor inom subcellulära regioner i vissa subtyper av CNS-neuroner för att bättre förstå mekanismerna bakom nikotinberoende med hjälp av en kombination av metoder, bland annat fluorescerande proteinet märkning av receptorn med hjälp av knock-in och spektrala konfokal bildalstring.
Ligand-jonkanaler i det centrala nervsystemet (CNS) är inblandade i många förhållanden med allvarliga medicinska och sociala konsekvenser. Till exempel är beroende av nikotin via tobaksrökning en ledande orsak till för tidig död i världen (World Health Organization) och troligt orsakat av en förändring av jonkanal fördelning i hjärnan 1. Kronisk exponering för nikotin i både gnagare och människor resulterar i ett ökat antal nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) i hjärnvävnad 1-3. På samma sätt har förändringar i de glutamaterga GluN1 eller GluA1 kanaler varit inblandad i att utlösa sensibilisering mot andra beroendeframkallande droger som kokain, amfetamin och opiater 4-6.
Följaktligen är förmågan att kartlägga och kvantifiera distribution och expression mönster av specifika jonkanaler kritiskt viktiga för att förstå mekanismerna för missbruk. Studiet av hjärnan regionspecifik effekter av enskilda läkemedel framfördes av tillkomsten av tekniker såsom radioaktiva ligander. Emellertid förhindrar den låga spatiala upplösningen av radioaktiv ligand-bindning förmågan att kvantifiera ligandstyrda jonkanaler i specifika undertyper av neuroner.
Genetiskt kodade fluorescerande reportrar, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och dess många varianter färg, har revolutionerat området biologi 7. Genom att genetiskt märka en fluorescerande reporter till ett endogent protein kan man visualisera proteiner in vivo 7-10. En fördel med fluorescerande märkning proteiner med en sond är att eliminera antikroppar används, som har frågor om specificitet och tillgängligheten till målproteinet. Vi har använt denna strategi för att fluorescerande märka nAChRs, vilket gjorde att studien av receptorn montering med Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transfekterade odlade celler 11. På senare tid har vi använt knock-in att konstruera möss med gula fluorescerande proteinet taggade a4 nAChR subenheter (α4YFP), vilket möjliggör exakt kvantifiering av receptorn ex vivo vid submikrometer upplösning i CNS-neuroner via spektrala konfokalmikroskopi 12. Den riktade fluorescerande knock-in mutation ingår i det endogena stället och under kontroll av dess naturliga promotor, som producerar normala nivåer av uttryck och reglering av receptorn jämfört med otaggade receptorer i vildtyp möss. Detta knock-in kan utvidgas till fluorescerande märka andra jonkanaler och erbjuder en kraftfull strategi för att visualisera och kvantifiera receptorer i CNS.
I denna uppsats beskriver vi en metod för att kvantifiera förändringar i nAChR uttryck i specifika CNS neuroner efter exponering för kroniska nikotin. Våra metoder innefattar mini-osmotisk pump implantation intrakardiell perfusion fixering, avbildning och analys av fluorescensmärkta nikotinsyra RECeptor subenheter från α4YFP knock-in-möss (figur 1). Vi har optimerat fixeringen tekniken för att minimera autofluorescens från fast hjärnan tissue.We i detalj beskriva vårt avbildning metodik med hjälp av en spektral konfokalmikroskop i samband med en linjär spektral unmixing algoritm för att subtrahera autofluoresent signal för att exakt få α4YFP fluorescenssignal. Slutligen visar vi resultatet av kronisk nikotin-inducerad uppreglering av α4YFP receptorer i den mediala perforanta banan av hippocampus.
The authors have nothing to disclose.
Anthony Renda stöddes av en University of Victoria Graduate Fellowship Award. Denna forskning stöds av en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Discovery Grant, en NARSAD Young Investigator Award (till RN), en Victoria Foundation – Myre och Winifred Sim Fund, en kanadensisk stiftelse för innovation bidrag ett British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Research Verktyg och Instrumentation Grant. Vi tackar Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald och Daniel Morgado utmärkt mus djurhållning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
saline | Teknova | S5819 | |
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |