Spektral konfokal afbildning af Fluorescerende mærkede nikotinreceptorer i Knock-i mus med kronisk Nikotin Administration

Summary

Vi har udviklet en ny teknik til at kvantificere nicotinacetylcholinreceptorneurotransmission ændringer inden for subcellulære regioner af specifikke undertyper af CNS-neuroner til bedre at forstå mekanismerne i nikotintrangen ved hjælp af en kombination af metoder, herunder fluorescerende protein tagging af receptoren ved hjælp af knock-in tilgang og spektral konfokal billeddannelse.

Abstract

Ligand-gatede ionkanaler i centralnervesystemet (CNS) er impliceret i talrige betingelser med alvorlige medicinske og sociale følger. For eksempel er afhængighed af nikotin via tobaksrygning en førende årsag til for tidlig død på verdensplan (World Health Organization), og er sandsynligvis forårsaget af en ændring af ion-kanal fordeling i hjernen ^1. Kronisk eksponering for nikotin i både gnavere og mennesker resulterer i forøgede antal af nicotinacetylcholinreceptorer (nAChRs) i hjernevæv ^1-3. Ligeledes har ændringer i glutamaterge GluN1 eller GluA1 kanaler blevet impliceret i at udløse sensibilisering andre vanedannende stoffer, såsom kokain, amfetamin og opiater ^4-6.

Følgelig evnen til at kortlægge og kvantificere distribution og ekspressionsmønstre af specifikke ionkanaler er kritisk vigtigt at forstå mekanismerne i afhængighed. Undersøgelsen af ​​hjerne region-specifikke efeffekter af individuelle lægemidler blev fremført ved fremkomsten af ​​teknikker såsom radioaktive ligander. Den lave rumlige opløsning af radioaktiv ligand binding forhindrer muligheden for at kvantificere ligand-gatede ionkanaler i specifikke undertyper af neuroner.

Genetisk indkodede fluorescerende reportere, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og mange andre farver, har revolutioneret inden for biologi ^7. Ved genetisk mærkning af en fluorescerende reporter til et endogent protein kan man forestille proteiner in vivo ^7-10. En fordel ved fluorescens mærkning proteiner med en probe er elimineringen af ​​antistof brug, som har problemer med nonspecificity og tilgængelighed til målproteinet. Vi har brugt denne strategi til fluorescens-mærke nAChRs, som gjorde det muligt for studiet af receptoren samling bruge Förster Resonance Energy Transfer (FRET) i transficerede dyrkede celler ^11. Nylig, har vi brugt knock-in tilgang til ingeniør mus med gult fluorescerende protein tagged a4 nAChR underenheder (α4YFP), hvilket muliggør præcis kvantificering af receptoren ex vivo ved submikrometer opløsning i CNS-neuroner via spektral konfokal mikroskopi ^12. Den målrettede fluorescerende knock-in mutation er inkorporeret i det endogene locus og under kontrol af dens native promotor, der producerer normale niveauer af ekspression og regulering af receptoren sammenlignet med umærkede receptorer i vildtype-mus. Dette knock-i fremgangsmåde kan udvides til fluorescens mærke andre ionkanaler og giver en kraftig metode til at visualisere og kvantificere receptorer i CNS.

I dette papir beskriver vi en metode til at kvantificere ændringer i nAChR udtryk i specifikke CNS-neuroner efter udsættelse for kronisk nikotin. Vores metoder omfatter mini-osmotisk pumpe implantation, intrakardial perfusion fiksering, billedbehandling og analyse af fluorescens mærket nikotinsyre receptor underenheder fra α4YFP knock-i mus (fig. 1). Vi har optimeret fiksering teknikken for at minimere autofluorescens fra fast hjerne tissue.We detaljeret beskrivelse vores billeddannelse metode under anvendelse af en spektral konfokalt mikroskop i forbindelse med en lineær spektral unmixing algoritme til at subtrahere autofluoresent signal for nøjagtigt at opnå α4YFP fluorescenssignal. Endelig viser vi resultatet af kronisk nikotin-fremkaldt opregulering af α4YFP receptorer i den mediale perforante sti i hippocampus.

Protocol

1. Pumpe implantation Før pumpen implantation, fylde og forberede Alzet mini-osmotiske pumper (Alzet, model 2002, Cupertino, USA) er forsigtig med ikke at indføre luftbobler. Denne model af mini-osmotisk pumpe leverer opløsning ved en hastighed på 0,5 gl / time i 14 dage. Sikre sterile forhold. Vejes tomme og fyldte pumper. Ved afslutningen af ​​forsøget (10 dage efter implantation), kan den resterende væske i pumpen fjernes med en sprøjte og nål og vejet til beregning af den pumpes. Pum…

Discussion

<p class="jove_content"> Anvendelsen af ​​et fluorescerende receptor i en afsmittende i musemodel til at bestemme mængden og lokalisering af en specifik ion-kanal tilvejebringer et antal fordele. I modsætning til proteiner såsom actin, som er ubikvitært udtrykt i alle celler, er ionkanaler stede i meget færre antal og deres ekspression varierer mellem neuronale undertyper gør nøjagtig analyse via traditionelle immunohistokemiske teknikker udfordrende. Den α4YFP genproduktet udtrykkes på WT niveauer, under kontrol af de samme pro…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
mini-osmotic pumps	Alzet	model 2002
saline	Teknova	S5819
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt	Sigma	N5260
eye drops	Novartis	Tear-Gel
Vetbond glue	3M	1469SB
heparin sodium salt	Sigma	H4784
10x PBS	Invitrogen	70011
ketamine	Wyeth Animal Health	0856-4403-01
medatomidine hydrochloride	Pfizer	1950673
23G butterfly needle	Becton Dickinson	367253
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
plastic embedding mold	VWR	18986-1
O.C.T. Mounting Compound	Tissue-Tek	4583
Mowiol 4-88	EMD-Calbiochem	475904	pH 8.5