I denne artikkelen beskriver vi bruk av magnetiske pinsett for å studere effekten av kraft på enzymatisk proteolyse på ett molekyl-nivå i en svært parallelizable måte.
Den generasjonen og påvisning av mekaniske krefter er en allestedsnærværende del av cellefysiologi, med direkte relevans for kreft pt metastasering, atherogenesis 2 og sårtilheling tre. I hvert av disse eksemplene, cellene både utøver makt på sine omgivelser og samtidig enzymatisk oppussing ekstracellulær matrix (ECM). Effekten av krefter på ECM har dermed blitt et område av stor interesse på grunn av sin sannsynlig biologisk og medisinsk betydning 4-7.
Enkle molekyl teknikker som optisk fangst 8, atomic force mikroskopi 9, og magnetiske pinsett 10,11 tillate forskere å undersøke funksjonen av enzymer på et molekylært nivå ved å utøve krefter på individuelle proteiner. Av disse teknikkene, magnetiske pinsett (MT) er kjent for sine lave kostnader og høy gjennomstrømning. MT øve styrker i området ~ 1-100 PN og kan gi millisekund tidsmessig oppløsning,kvaliteter som er godt tilpasset studiet av enzymet mekanisme på enkelt-molekyl nivå 12. Her rapporterer vi en svært parallelizable MT analysen for å studere effekten av kraften på proteolyse av single proteinmolekyler. Vi presenterer den spesifikke eksempel på proteolyse av en trimeric kollagen peptid ved matrise metalloproteinase 1 (MMP-1), men kan denne analysen enkelt tilpasses til å studere andre underlag og proteaser.
Denne protokollen beskriver en ny bruk for en klassisk enkelt molekyl teknikk. Magnetiske pinsett tillate middels til høy gjennomstrømming ett molekyl essay i en kostnadseffektiv måte. Men som alle eksperimentelle teknikker det er utfordringer og potensielle fallgruver.
Begrensninger av magnetiske pinsett
Sammenlignet med en optisk felle den romlige og tidsmessige oppløsningen på en MT apparat er lav. Videre kreftene som genereres av den enkle MT beskrevet her,…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Burroughs Wellcome Karriere Award på Scientific Interface (ARD), National Institutes of Health gjennom NIH direktørens New Innovator Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ), og Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (JC). Forfatterne takker James Spudich for loaning mikroskopi utstyr.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
z-translator | Thorlabs | MTS50 |
Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |