Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett
Summary
I denne artikkelen beskriver vi bruk av magnetiske pinsett for å studere effekten av kraft på enzymatisk proteolyse på ett molekyl-nivå i en svært parallelizable måte.
Abstract
Den generasjonen og påvisning av mekaniske krefter er en allestedsnærværende del av cellefysiologi, med direkte relevans for kreft pt metastasering, atherogenesis 2 og sårtilheling tre. I hvert av disse eksemplene, cellene både utøver makt på sine omgivelser og samtidig enzymatisk oppussing ekstracellulær matrix (ECM). Effekten av krefter på ECM har dermed blitt et område av stor interesse på grunn av sin sannsynlig biologisk og medisinsk betydning 4-7.
Enkle molekyl teknikker som optisk fangst 8, atomic force mikroskopi 9, og magnetiske pinsett 10,11 tillate forskere å undersøke funksjonen av enzymer på et molekylært nivå ved å utøve krefter på individuelle proteiner. Av disse teknikkene, magnetiske pinsett (MT) er kjent for sine lave kostnader og høy gjennomstrømning. MT øve styrker i området ~ 1-100 PN og kan gi millisekund tidsmessig oppløsning,kvaliteter som er godt tilpasset studiet av enzymet mekanisme på enkelt-molekyl nivå 12. Her rapporterer vi en svært parallelizable MT analysen for å studere effekten av kraften på proteolyse av single proteinmolekyler. Vi presenterer den spesifikke eksempel på proteolyse av en trimeric kollagen peptid ved matrise metalloproteinase 1 (MMP-1), men kan denne analysen enkelt tilpasses til å studere andre underlag og proteaser.
Protocol
Discussion
Denne protokollen beskriver en ny bruk for en klassisk enkelt molekyl teknikk. Magnetiske pinsett tillate middels til høy gjennomstrømming ett molekyl essay i en kostnadseffektiv måte. Men som alle eksperimentelle teknikker det er utfordringer og potensielle fallgruver.
Begrensninger av magnetiske pinsett
Sammenlignet med en optisk felle den romlige og tidsmessige oppløsningen på en MT apparat er lav. Videre kreftene som genereres av den enkle MT beskrevet her,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Burroughs Wellcome Karriere Award på Scientific Interface (ARD), National Institutes of Health gjennom NIH direktørens New Innovator Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ), og Stanford Cardiovascular Institute Younger Predoctoral Fellowship (JC). Forfatterne takker James Spudich for loaning mikroskopi utstyr.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Referências
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
