Een methode voor het foto-inkapseling van cellen in een verknoopt PEG hydrogel wordt beschreven. Hypoxische signalering binnen ingekapseld murine insulinoom (MIN6) aggregaten is gevolgd met behulp van een fluorescerende marker-systeem. Dit systeem maakt serie onderzoek van de cellen binnen een hydrogel steiger en correlatie van hypoxische signalering met veranderingen in de cel fenotype.
In Diabetes mellitus type 1, auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen resulteert in het verlies van de productie van insuline en potentieel dodelijke hyperglykemie. Als een alternatieve behandelingsoptie zijn voor exogene insuline-injectie, is transplantatie van functionele pancreas weefsel onderzocht 1,2. Deze aanpak biedt de belofte van een meer natuurlijke, lange termijn herstel van normoglycemia. Bescherming van de donor weefsel van het immuunsysteem van de gastheer nodig om te voorkomen dat afwijzing en inkapseling is een methode die wordt gebruikt om te helpen dit doel te bereiken.
Biologisch afgeleide materialen, zoals alginaat 3 pt 4 agarose, zijn de traditionele keuze voor de capsule de bouw, maar kan een ontsteking of een fibrotische overgroei 5 die voedingsstoffen en zuurstof transport kunnen belemmeren induceren. Als alternatief, synthetische poly (ethyleenglycol) (PEG)-gebaseerde hydrogels zijn niet-afbrekende, gemakkelijk gefunctionaliseerde, beschikbaar op hoge zuiverheid,hebben regelbare poriegrootte, en zijn extreem biocompatibel, 6,7,8. Als bijkomend voordeel, kan PEG hydrogels snel worden gevormd in een eenvoudige foto-crosslinking reactie die niet nodig is de toepassing van niet-fysiologische temperaturen 6,7. Een dergelijke procedure wordt hier beschreven. In de verknopingsreactie, UV degradatie van de foto-initiator, 1 – [4 – (2-hydroxyethoxy)-fenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propaan-1-een (Irgacure 2959), produceert vrije radicalen die aanval de vinyl koolstof-koolstof dubbele bindingen van dimethacrylated PEG (PEGDM) induceren verknoping aan de ketting uiteinden. Verknoping kan worden bereikt binnen 10 minuten. PEG hydrogels gebouwd op een zodanige wijze is aangetoond dat ze positief te ondersteunen cellen 7,9, en de lage fotoinitiator concentratie en korte blootstelling aan UV-straling is niet schadelijk voor de levensvatbaarheid en functie van de ingekapselde weefsel 10. Terwijl we methacrylaat onze PEG met de hierna beschreven methode, kan PEGDM ook directly gekocht van leveranciers zoals Sigma.
Een inherent gevolg van inkapseling is isolatie van de cellen van een vasculaire netwerk. Aanvoer van voedingsstoffen, met name zuurstof, is daarom verminderd en beperkt door diffusie. Deze verminderde beschikbaarheid van zuurstof kan met name gevolgen voor β-cellen waarvan de insuline secretie functie is sterk afhankelijk van zuurstof 11-13. Capsule samenstelling en de geometrie zal ook gevolgen hebben diffusie tarieven en lengtes voor zuurstof. Daarom hebben we ook een beschrijving van een techniek voor het identificeren van hypoxische cellen binnen onze PEG capsules. Infectie van de cellen met een recombinant adenovirus zorgt voor een fluorescent signaal wordt geproduceerd wanneer intracellulaire hypoxia-induceerbare factor (HIF) paden worden geactiveerd 14. Omdat HIFs zijn de belangrijkste regulatoren van de transcriptionele respons op hypoxie, zij vertegenwoordigen een ideaal doelwit marker voor de detectie van hypoxische signalering 15. Deze aanpak zorgt voor eenvoudige en snelle detectie van HYPOXIc cellen. Kortom, het adenovirus is de sequentie voor een rood fluorescerend eiwit (Ds Red DR uit Clontech) onder de controle van een hypoxie-responsief element (HRE) trimeer. Stabilisatie van HIF-1 door lage zuurstofgehalte zal rijden transcriptie van het fluorescente eiwit (figuur 1). Aanvullende details over de bouw van dit virus zijn eerder 15 gepubliceerd. Het virus wordt opgeslagen in 10% glycerol bij -80 ° C zoveel 150 pi porties in 1,5 ml centrifugebuis bij een concentratie van 3,4 x 10 10 PFU / ml.
Eerdere studies in ons laboratorium hebben aangetoond dat MIN6 cellen ingekapseld als aggregaten behouden hun levensvatbaarheid gedurende vier weken van de cultuur in 20% zuurstof. MIN6 aggregaten gekweekt op 2 of 1% zuurstof beide tekenen van necrotische cellen (nog ongeveer 85-90% levensvatbare) toonde door kleuring met ethidiumbromide en morfologische veranderingen ten opzichte van cellen in 20% zuurstof. De gladde bolvormige vorm van de aggregaten worden weergegeven op 20% was lost en aggregaten leek meer op ongeorganiseerde groepen van cellen. Terwijl het lage zuurstof-spanning niet leiden tot een uitgesproken daling van de levensvatbaarheid, is duidelijk van invloed MIN6 aggregatie en functie zoals gemeten door glucose-gestimuleerde insuline secretie 15. Western blot analyse van ingekapselde cellen in 20% en 1% zuurstof toonde ook een significante toename van HIF-1α voor cellen gekweekt in het lage zuurstofgehalte, die correleert met de expressie van de DsRed DR eiwit.
De hier gepresenteerde methode biedt een snelle en eenvoudige techniek voor mobiele inkapseling in een PEG hydrogel met minimale gebruik van niet-fysiologische omstandigheden. PEG is een zeer nuttige inkapseling materiaal voor de biocompatibiliteit en het gemak van de wijziging. Eenvoudige variatie van PEG percentage in het fotoactieve oplossing, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om mechanische eigenschappen, zoals druk-modulus, en transport eigenschappen aan te passen door middel van poriegrootte. Ook is PEG eenvoudig worden aangepast door de toevoeging van zijketens. PEG hydrogels, dus, is zowel een veelbelovende klinische apparaat en een flexibel platform voor in-vitro-onderzoek
Een methode voor het bijhouden van hypoxie in de PEG-ingekapselde cellen is ook gepresenteerd. Deze methode is handig voor de eenvoud van hypoxie detectie en voor het voorkomen van de noodzaak om de cellen van belang te offeren. De techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van soorten cellen in een uiteenlopende omstandigheden te maken zijn wijefulness breed. Zo kan hypoxie als een cue voor de stamcellen differentiatie worden bijgehouden in stamcellen Micromass culturen. Toch kan deze methode alleen worden toegepast op cel-systemen of systeem waarin verspreide cellen zijn later samengevoegd verspreiden. Ook kan de detectie van het fluorescentie-signaal moeilijk zijn in grotere of dichter weefsels.
The authors have nothing to disclose.
Dankzij de Kristi Anseth lab van de Universiteit van Colorado, Boulder voor het leveren van ruim MIN6 cellen. Financiering voor dit project is verstrekt door de NSF.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional |
PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
Microwave | Emerson | MW8784SB | |
Vortexer | Scientific Industries | SI-A236 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
Laboratories | |||
Freezer | |||
Lyophilizer | Labconco | 7670521 | |
Vacuum pump | Welch | 8917Z-01 | |
Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
HBSS | Mediatech | 21-022-CV | |
Syringe Filter | VWR | 28145-477 | |
RPMI 1640 | Mediatech | * | *custom formulation |
FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
Amphotericin B | Mediatech | 30-003-CF | |
Incubator | Thermo Scientific | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
Trypsin EDTA | Mediatech | 25-052-CI | |
Orbital Shaker | VWR | 12620-926 | |
UV Lamp | Sanyo Denri | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
Microscope | Nikon | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |